CONSEQUENCES DE L’EXPOSTION A L’URANIUM NATUREL SUR LES CELLULES OSTEOCYTAIRES MLO-A5

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MATERIELS ET METHODES

CULTURE CELLULAIRE

Lignée ostéoclastique
Les cellules RAW 264.7, lignée cellulaire murine de monocytes-macrophages obtenues auprès de l’ATCC (American Type Culture Collection) sont cultivées en Dulbecco’s modified Eagle Medium (DMEM, Lonza) supplémenté avec 5 % de Sérum de Veau Fœtal (SVF) (HyClone, GE Healthcare), 1 % d’antibiotiques P/S (100 IU/ml Pénicilline, Streptomycine 100µg/ml, Sigma-Aldrich) sous atmosphère contrôlée à 37°C, 5 % CO2. Les cellules sont transférées par grattage mécanique ; seules les cellules de passages 4 à 9 sont utilisées dans les expériences de différenciation. Les RAW 264.7 sont ensemencées à 1000 cellules/cm2 en plaques 24 puits trois jours avant le début de la différentiation. Le support de culture est une plaque en polyéthylène téréphtalate (Falcon) pour les expériences d’analyse de l’ostéoclastogénèse ou une plaque présentant une surface résorbable mimant la phase minérale de l’os (OsteoassayTM , Corning Life Science). Le milieu de culture est ensuite remplacé par du αMEM (Lonza) supplémenté avec 5 % de SVF (PAA Laboratories), 2 mM de L-glutamine (Sigma-Aldrich), sans antibiotiques et contenant 50 à 70 ng/mL de cytokine GST-RANK-L (production interne) pour initier la différenciation en ostéoclastes.
Lignée ostéoblastique Les UMR-106, une lignée d’ostéosarcome de rat (ostéoblastes), sont cultivées en DMEM (Lonza) supplémenté avec 10 % de SVF (HyClone, GE Healthcare), 1 % de P/S. Pour les expériences de minéralisation, les UMR-106 sont ensemencées à 2000 cellules /cm2 en plaque 24 puits (Falcon). Après adhésion des cellules, le milieu est remplacé par un milieu ostéogénique constitué d’αMEM (Lonza), de 10 % de SVF (HyClone, GE Healthcare), de 2 mM de L-Glutamine (Sigma-Aldrich), de 1,4 mM de CaCl2 (Sigma-Aldrich), de 50 µg/mL d’acide ascorbique (Sigma-Aldrich) et de 20 µg/mL de dexaméthasone (Sigma-Aldrich) pendant 3 jours. Les cellules sont ensuite cultivées dans le même milieu complété de 50 mg/mL de β-glycérophosphate (Sigma-Aldrich) pour les jours suivants.

Résultats

EXPOSITION A L’ACETATE D’URANYLE ET AU HOPO

La solution mère d’acétate d’uranyle (UA) (100 mM, pH 4) est diluée dans une solution de bicarbonate de sodium (100 mM, Gibco, LifeTechnologies) dans le but de neutraliser le pH de la solution. Après trois heures de stabilisation à température ambiante, cette solution est diluée goutte à goutte dans le milieu de culture des cellules pour atteindre la concentration voulue. Ces solutions sont ensuite ajoutées sur les cellules après trois heures de stabilisation de la spéciation à température ambiante. Les solutions contrôles sont réalisées dans les mêmes conditions en remplaçant la solution d’UA par de l’eau stérile (Sigma). La poudre de HOPO fournie par l’équipe du Pr C. Den Auwer (ICN, Université de Nice) est solubilisée dans de l’eau pour atteindre une concentration de 40 mM puis conservée à 4°C, protégée de la lumière. La solution stock est ensuite diluée dans le milieu de culture à la concentration choisie puis ajoutée sur les cellules.
Pour les expériences de différenciation ostéoclastique, l’UA est dilué dans le milieu de différenciation ostéoclastique dès le début de la différenciation. Le HOPO est alors additionné dans le milieu contenant l’UA, juste avant l’ajout de cette solution sur les cellules, dès le début de la différenciation ou après deux jours. Les photos et les analyses de résorption sont effectuées après 4 jours de différenciation des OCs.
C. MINERALISATION ET COLORATION ALIZARINE
La coloration alizarine permet de visualiser les dépôts calciques par une coloration rouge. Les UMR-106 sont fixées en éthanol 100 % pendant une heure sur la glace, puis colorées à l’alizarine Red S dye 1 % (Alfa Aesar). Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, les cellules sont lavées en eau déminéralisée et des photos représentatives sont prises au microscope.
D. TEST MTT
La cytotoxicité de l’uranium est évaluée par le dosage colorimétrique MTT (methylthiazol tetrazolium). Le test MTT est un test qui permet d’évaluer l’activité métabolique des cellules et ainsi, leur viabilité. Après 5 jours en minéralisation, les cellules sont incubées en présence d’une solution de MTT à 37°C à l’obscurité pendant une heure. La solution de MTT est préparée en diluant dix fois la solution stock (5 mg/ml, Sigma-Aldrich) dans du milieu Eagle’s Minimum Essential Medium sans rouge phénol (EMEM, Lonza) complémenté de 10 % de SVF (HyClone, GE Healthcare). Les cellules vivantes métabolisent le MTT en cristaux de formazan lorsqu’elles sont vivantes. Après incubation, les cristaux intra-cellulaires de formazan sont dissous dans du DMSO (Sigma-Aldrich). La coloration violette de ces cristaux est proportionnelle à la viabilité. L’absorbance est mesurée à 570 nm (absorbance du formazan) et 690 nm (bruit de fond) par un lecteur de micro-plaques (SPECTROstar Nano, BMG Labtech). Pour l’analyse, l’absorbance du bruit de fond est déduite de l’absorbance spécifique à 570 nm. Celle obtenue pour les puits ne contenant pas de cellules est aussi retranchée. Après cette correction, la viabilité cellulaire est définie à 100 % pour les cellules non exposées au HOPO.
E. MARQUAGE TRAP
Les OCs expriment la protéine TRAP, une phosphatase acide résistante au tartrate. Le marquage de cette métalloprotéine permet la visualisation des ostéoclastes. Pour ce faire, après 4 jours de différenciation, les cellules sont incubées pendant 2 minutes à température ambiante dans une solution de fixation (3 % formaldéhyde, 66% acétone dans une solution de citrate 7mM). Après deux lavages à l’eau déionisée, les cellules sont mises en présence pendant 20 minutes à 37°C et à l’obscurité de la solution de marquage TRAP du kit Leukocyte acid phosphatase kit (Sigma-Aldrich). Après deux lavages à l’eau déionisée puis au PBS, des mosaïques d’environ 350 photos reconstituant la totalité de chaque puits (de plaque 24 puits) sont prises en utilisant le microscope inversé motorisé Axio Observer Z1 et le logiciel Zen (Zeiss). Les images sont ensuite analysées à l’aide du logiciel ImageJ pour déterminer le nombre d’OCs matures (3 noyaux au minimum, marqués TRAP) et leur taille dans les différentes conditions.

Table des matières

RESUME
REMERCIEMENTS
SOMMAIRE
TABLEAUX ET FIGURES
ABREVIATIONS
INTRODUCTION
ÉTAT DE L’ART
CHAPITRE I : L’URANIUM
I. GÉNÉRALITÉS
A. HISTORIQUE
B. PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES ET RADIOLOGIQUES..
C. UTILISATIONS..
II. L’URANIUM DANS L’ENVIRONNEMENT ET SITUATIONS D’EXPOSITIONS
A. EXPOSITION NATURELLE
B. EXPOSITIONS LIÉES AUX ACTIVITÉS HUMAINES
III. BIOCINÉTIQUE
A. ABSORPTION
B. DISTRIBUTION
C. METABOLISME
D. ÉLIMINATION
E. LE TRANSPORT SANGUIN DE L’URANIUM
CHAPITRE II : LE TISSU OSSEUX
I. GÉNÉRALITÉS
A. ORGANISATION
1. L’os compact
2. L’os spongieux
B. FONCTIONS DU TISSU OSSEUX
C. LA MATRICE OSSEUSE.
II. LES CELLULES OSSEUSES
A. LES OSTÉOCLASTES
1. Modèles de résorption in vitro
B. LES OSTÉOBLASTES
C. LES OSTÉOCYTES
1. Morphologie
2. Mécano-transduction
3. Autres rôles des ostéocytes
Homéostasie phospho-calcique
Ostéolyse ostéocytaire
4. Différentiation ostéocytaire et marqueurs
5. Les différents modèles cellulaires
III. LE REMODELAGE OSSEUX
A. DIFFÉRENCIATION OSTÉOCLASTIQUE ET RÉSORPTION
B. LA MINÉRALISATION
C. ORCHESTRATION DU REMODELAGE
1. Régulation de la formation osseuse
2. Régulation de la résorption osseuse
3. Rôle de la mort des ostéocytes
D. ROLE DE L’AUTOPHAGIE
Définition
Mécanisme
Rôle dans l’os
CHAPITRE III : TOXICITÉ DE L’URANIUM ET MÉTAUX LOURDS DANS L’OS
I. TOXICITÉ DE L’URANIUM
A. EFFETS SUR LE REIN
B. EFFETS SUR L’OS
1. In vivo
2. In vitro
C. EFFETS SUR LES AUTRES ORGANES
II. MÉTAUX LOURDS ET OS.
III. LA DÉTOXIFICATION DE L’URANIUM
A. Le DTPA..
B. LE 3,4,3-LI(1,2-HOPO)
C. AUTRES DECORPORANTS
RESULTATS
CHAPITRE I : CONSEQUENCES DE L’EXPOSTION A L’URANIUM NATUREL SUR LES CELLULES OSTEOCYTAIRES MLO-A5
I. PRESENTATION
II. ARTICLE EN COURS DE SOUMISSION
Sample preparation
Data acquisition, processing and analysis
References
III. MATERIELS ET METHODES COMPLEMENTAIRES
A. ANALYSES QPCR
B. EXTRACTION PROTEIQUE ET ANALYSE PAR WESTERN BLOT
IV. RESULTATS COMPLEMENTAIRES
V. DISCUSSION ET CONCLUSION
CHAPITRE II : EVALUATION DE L’EFFET D’UN DECORPORANT POTENTIEL DE L’URANIUM, LE 3,4,3-LI(1,2-HOPO), SUR LES OSTEOBLASTES ET LES OSTEOCLASTES
I. PRESENTATION
II. MATERIELS ET METHODES.
A. CULTURE CELLULAIRE
B. EXPOSITION A L’ACETATE D’URANYLE ET AU HOPO
C. MINERALISATION ET COLORATION ALIZARINE
D. TEST MTT
E. MARQUAGE TRAP
F. ANALYSE DE LA RESORPTION
G. QUANTIFICATION DE L’URANIUM PAR ICP-MS
H. STATISTIQUES
III. RESULTATS
A. EFFET DU HOPO SUR LES OSTEOCLASTES
B. EFFET DE L’UA EN PRESENCE DE HOPO SUR LES OSTEOCLASTES
C. FIXATION DE L’URANIUM SUR LES SUPPORTS BIO-MIMETIQUES
D. EFFET DU HOPO SUR LES OSTEOBLASTES
IV. DISCUSSION ET CONCLUSION
DISCUSSION GENERALE
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE