ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE ET SUR COUCHE MINCE DE RESIDUS DE PESTICIDES

ANALYSE PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE ET SUR COUCHE MINCE DE RESIDUS DE PESTICIDES

METHODES D’ANALYSE DES PESTICIDES 

Plusieurs méthodes analytiques sont souvent utilisées pour évaluer la teneur en résidus de pesticides dans les eaux. De ce fait nous pouvons citer : les chromatogrammes tels que le HPLC, le CPG et le CCM, et les spectrométries de l’UV/visible, de masse, de l’Infrarouge et de la RMN. Par ailleurs le HPLC, le CCM et l’UV/visible demeurent les plus utilisés dans le cadre de cette étude.

Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)

Un chromatographe en phase gazeuse (CG) mesure le contenu des différentes composantes dans un échantillon. La solution de l’échantillon injectée dans l’instrument entre dans un flux gazeux, qui transporte de l’échantillon dans un tube de séparation connue sous le nom de colonne. L’hélium ou l’azote est utilise comme ce gaz transporteur. Les composants sont séparés à l’intérieur de la colonne. Le détecteur mesure la quantité de composants à la sortie de la colonne. Pour mesurer un échantillon avec une concentration inconnue, un échantillon standard avec une concentration connue est injecté dans l’instrument. 

Chromatographie Liquide à Haute Pression (HPLC)

Contrairement à la CPG, la chromatographie liquide à haute pression permet d’analyser des substances thermiquement instables, peu volatiles et même des sels. L’échantillon à analyser peut être injecté à pression ordinaire dans une boucle d’injection. Ce petit volume est mis en communication par un système de vanne avec la phase mobile composée d’un ou de plusieurs solvants. Après rétention par la phase stationnaire placée tout au long de la colonne, les substances analysées se détectent à la sortie par un détecteur. Le détecteur le plus rependu est le spectromètre d’absorption dans l’ultraviolet et le visible. A ceci s’ajoute bien évidemment un outil informatique d’acquisition du chromatogramme qui sert aussi parfois au pilotage des pompes, de l’injecteur, du détecteur. III.3 Chromatographie sur Couche Mince (CCM) La CCM repose principalement sur des phénomènes d’absorption : la phase mobile est un mélange de solvants, qui progresse le long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou de sur une feuille semi-rigide de matière plastiques ou d’aluminium. Après que l’échantillon est été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle des solvants. Les principaux éléments en CCM sont: 40 la cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un couvercle étanche, la phase stationnaire : une couche d’environ 0,25 mm de gel de silice ou d’un autre adsorbant est fixée sur une plaque de verre à l’aide d’un liant comme le sulfate de calcium hydraté, l’amidon ou un polymère organique, l’échantillon : environ un microlitre de solution diluée (2 à 5%) du mélange à analyser est déposé sur le papier, l’éluant : un solvant pur ou un mélange de solvants migre lentement le long de la plaque en entraînant les composants de l’échantillon. 1) Principe de la technique Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l’échantillon est placée dans la cuve, l’éluant migre à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque composant de l’échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant. Cette vitesse dépend d’une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la plaque stationnaire et, d’autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Les composés se déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile, l’action de rétention de la phase stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes d’adsorption. Généralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarité migrent plus rapidement que les composants polaires. 2) Analyse qualitative ou quantitative Du fait que nos échantillons sont incolores, il est nécessaire que nous visualisons nos spots par une réaction colorée (qui peut être générale ou spécifique) ou par fluorescence d’où la révélation. L’identification des constituants du mélange se fait par comparaison avec des témoins, en calculant le Rf (rapport frontal) de chaque soluté, ou encore le Rt (rapport à un témoin) lorsque le solvant a dépassé le niveau supérieur de la plaque (René L, 2005). Le CCM nous a permis donc de vérifier les résultats obtenus par l’analyse HPLC. III .4 Chromatographie de Résonnance Magnétique Nucléaire La RMN est basée sur la mesure de l’absorption d’ondes électromagnétiques dans les domaine de fréquence radio, qui s’étend approximativement de 4 à 1000Mhz. Contrairement à l’absorption dans l’ultra violet, le visible et l’infrarouge, ce sont les noyaux des atomes, et non plus les électrons, qui sont impliqués dans le phénomène d’absorption. De plus, il est nécessaire de placer 41 l’analyse dans un champ magnétique intense pour que les noyaux puissent être amenés à un état énergétique supérieur par l’absorption d’un rayonnement. La RMN est l’un des outils parmi les plus puissants dont dispose le chimiste et le biochimiste pour déterminer la structure des espèces chimiques. Cette technique a aussi une grande utilité dans l’analyse qualitative des espèces absorbantes (Becker E .D. 1980 ; Bovery F.A., 1988) III.5 Spectroscopie Ultra Violet-Visible La spectroscopie ultraviolet-visible ou spectrométrie ultraviolet-visible est une technique de spectroscopie mettant en jeu les photons dont les longueurs d’onde sont dans le domaine des ultraviolets (200 nm – 400 nm), du visible, et jusqu’au proche infrarouge (750 nm -1400 nm). Soumises à un rayonnement dans cette gamme de longueurs d’onde, les molécules subissent une transition électronique. Cette technique est complémentaire de la spectroscopie de fluorescence en ce sens que la fluorescence met en jeu des transitions depuis l’état excité jusqu’à l’état fondamental alors que la spectroscopie d’absorption traite des transitions entre état fondamental et état excité(Thomson Brooks and Cole. 2007). Les longueurs d’onde d’absorptions des standards des pesticides ont été obtenues par la spectrométrie en UV/visible. III.6 La Spectroscopie Infrarouge (IR) L’IR moderne est un outil polyvalent permettant l’analyse qualitative et quantitative de nombreuses espèces moléculaires. Ses applications se classent en trois grandes catégories basées sur les trois régions spectrales de l’IR : l’IR moyen est la région la plus utilisée et qui s’étend de 670 à 4000 cm -1 où l’on utilise les spectres d’absorption, d’émission et de réflexion dans le but d’analyse qualitative de routine de certaines espèces telles que l’eau, le dioxyde de carbone, etc, l’IR lointain est un domaine qui a été initialement exploité pour déterminer les structures d’espèces inorganiques et d’espèces organométalliques, la région de l’IR proche. La spectrométrie d’absorption et de réflexion dans l’IR moyen constitue un outil majeur de détermination de la structure des molécules inorganiques et biochimiques (Colt up N.D, Daly L.H.and Wiberley S.E, 2006). III.7 Spectrométrie de Masse La spectrométrie de masse est une technique physique d’analyse permettant de détecter et d’identifier des molécules d’intérêt par mesure de leur masse, et de caractériser leur structure chimique. 42 Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). La spectrométrie de masse est utilisée dans pratiquement tous les domaines scientifiques : physique, astrophysique, chimie en phase gazeuse, chimie organique, dosages, biologie, médecine…. 

TECHNIQUES ALTERNATIVES A L’UTILISATION DES PESTICIDES

Des alternatives à l’utilisation des pesticides apparaissent donc comme essentielles en vue de préserver une qualité de vie. Des approches sont envisageables : d’abord l’enseignement des bonnes pratiques agricoles, ensuite l’introduction massive d’auxiliaires (lutte biologique) et enfin la lutte chimique raisonnée. IV.1 Bonnes Pratiques Agricoles Le concept de Bonnes Pratiques Agricoles (BPA) a évolué ces dernières années dans un contexte économique et alimentaire qui change et se mondialise rapidement. Cette évolution est également liée aux préoccupations et engagements de nombreuses parties prenantes pour assurer production et sécurité alimentaires, sûreté et qualité des aliments ainsi qu’un environnement durable. Les bonnes pratiques agricoles s’appuient sur les recommandations et les connaissances disponibles pour favoriser une production de l’exploitation agricole et des processus durables qui s’en suivent en termes environnemental, économique et social, tout en générant des produits agricoles alimentaires. Les BPA constituent un ensemble de règles à respecter dans l’implantation et la conduite des cultures de façon à optimiser la production agricole, tout en réduisant le plus possible les risques liés à ces pratiques, tant vis-à-vis de l’homme que vis-à-vis de l’environnement. Viser l’efficience maximale de tout facteur de production est un objectif impérieux d’une agriculture rentable et durable. La fertilisation n’échappe pas à cette règle ; il faut obtenir un rendement optimal, atteindre les objectifs de qualité de la production et minimiser les reliquats, sources éventuelles de déséquilibre des sols et de pollution. Pour l’agriculteur, la contrainte environnementale doit être prise en compte au même titre que la nécessité économique. 43 Limites de la bonne pratique agricole  Niveau d’instruction des agriculteurs pour respecter les seuils d’intervention.  Manque de techniciens spécialisés pouvant faire le suivi de la dynamique des ravageurs dans les exploitations agricoles.  Utilisation fréquente par les agriculteurs des produits chimiques : insecticides, fongicides, herbicides, etc.  Budget limité des agriculteurs pour l’achat des pièges et d’autres moyens utilisés en lutte intégrée.  Présence d’un nombre limité de sociétés commercialisant les pièges, les capsules à phéromones, etc.  Rareté de sessions d’encadrement pour les agriculteurs leur assurant un encadrement suffisant en matière de connaissance des ravageurs, et d’évolution des seuils utilisés.

La Lutte Biologique 

C’est un moyen élégant de réduire les effets d’un organisme (animal ou plante) gênant, en le faisant dévorer par un de ses ennemis naturels. Les insectes sont très présents dans la lutte biologique. D’abord comme cible : contre ravageur des cultures et vecteurs de maladies, on a recours aux services de bactéries, de champignons, de virus, de nématodes, de poissons et surtout d’autres insectes, prédateurs et parasites. En second lieu donc comme agent de lutte biologique (ou auxiliaire) pour détruire les insectes ravageurs ou gênants évoqués ci-dessus mais aussi des plantes indésirables, envahissant champs ou canaux. 2) Le principe La lutte biologique est basée sur l’exploitation par l’Homme et à son profit d’une relation naturelle entre deux êtres vivants :  la cible (de la lutte) est un organisme indésirable, ravageur d’une plante cultivée, mauvaise herbe, parasite du bétail… ;  l’agent de lutte (ou auxiliaire) est un organisme différent, le plus souvent un parasite (ou parasitoïde), un prédateur ou un agent pathogène du premier, qui le tue à plus ou moins brève échéance en s’en nourrissant ou tout au moins limite son développement. Ceci peut être un concurrent (lutte autocide, ci-dessous) (Fraval A., Silvy C. (dir.), 1999) Par conséquent une étude conduite en 1999-2000 par l’INRA, la COOPAGRI Bretagne et l’Ecole Supérieure de Microbiologie et de Sécurité Alimentaire (ESMISAB) visant à comparer les niveaux de contaminations par divers résidus toxiques des produits des agricultures biologiques et conventionnels est sans 44 appel (DGAL, 2001). Aucun des 78 résidus de pesticides recherchés dans cette étude n’a été retrouvé dans les 94 produits issus de l’agriculture biologique testés. L’AFSSA reconnaît aussi, dans un rapport (AFSSA, 2003) de 2003 que : « Le mode de production biologique, en proscrivant le recours aux produits phytosanitaires de synthèse, élimine les risques associés à ces produits pour la santé humaine et concourt à une moindre pollution environnementale, notamment de la ressource en eau.

Lutte chimique raisonnée et techniques culturales

Pour lutter contre les maladies des plantes pérennes tropicales, dans un certain nombre de cas, des solutions plus ou moins partielles sont trouvées par la sélection d’un matériel végétal résistant à des degrés divers et, dans de nombreuses autres situations, une solution génétique peut être apportée à plus ou moins long terme. La lutte contre les insectes vecteurs est souvent possible et efficace. Toutefois, pour plusieurs maladies, la lutte chimique reste indispensable. L’efficacité des pesticides peut parfois être renforcée par l’emploi de pratiques culturales simples mais quelquefois exigeantes en main-d’œuvre, difficiles à mettre en œuvre en l’absence d’aménagement des terroirs ou qui peuvent avoir certains effets défavorables (Berry D, 1999). Une protection efficace des cultures repose sur le diagnostic précis des problèmes phytosanitaires posés. Les techniques classiques d’identification sont aujourd’hui complétées par la caractérisation biologique, sérologique ou moléculaire de l’agresseur, ce qui permet de caractériser finement les souspopulations d’une même espèce d’ennemie de cultures que l’on fait inféodée à une espèce voire une variété végétale particulière. Par ailleurs la prévision des dégâts est aujourd’hui facile à la fois par des méthodes d’échantillonnage des parasites plus précises et par des modèles mathématiques faibles qui intègrent un nombre croissant de paramètres (cinétiques d’efficacité de la matière active, dynamique des populations d’ennemi, élaboration du rendement par la plante). Il est donc plus facile de savoir à quel moment intervenir contre les ravageurs et ainsi d’optimiser les traitements. Les nouvelles molécules proposées par les firmes phytosanitaires sont généralement sélectionnées pour des actions de plus en plus ciblées sur les groupes de parasites à détruire et pour leur élimination rapide dans l’environnement. Leur effets indésirables sont aussi réduits. Enfin le suivi de la résistance des insectes aux produits phytosanitaires peut se faire plus finement grâce à l’étude des déterminants biochimiques et génétiques.