Extraction de l’ADN génomique ou chromosomique

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Précipitation de l’ADN

Elle permet l’obtention d’ADN pur et concentré. La précipitation se fait, soit à l’éthanol 100% (dans ce cas, elle a lieu à –80°C et en présence de sels tels que l’acétate de Sodium), soit à l’isopropanol (le sel n’est pas nécessaire et la précipitation se fait alors à +4°C). Il faut ajouter deux volumes d’alcool par volume d’échantillon. L’isopropanol est utilisé volume/volume. Par conséquent, on préfère utiliser l’isopropanol pour des échantillons de grand volume. Un lavage ultérieur à l’éthanol 70% est indispensable pour éliminer les sels. Le précipité est repris par du tampon à faible force ionique : en général il s’agit du tampon TE (Tris 10 mM, EDTA 1mM).

Estimation des quantités d’ADN

Par lecture au spectrophotomètre La quantité d’ADN simple et double brin peut être calculé par spectrophotométrie en mesurant à 260 nm et 280 nm la densité optique (D.O) d’une dilution au 1/50é et 1/100é de la solution à doser. Le calcul suivant permet d’en déduire la concentration. Concentration (µ/mL) = 50 x (facteur de dilution) x D.O260 nm (1, 2) La mesure de la D.O à 280 nm permet de s’assurer de l’absence de contamination significative par les protéines. Le rapport D.O260nm/D.O280nm doit être compris entre 1,7 et 2. S’il est inférieur à 1,7, il existe une contamination qui impose de pratiquer une seconde extraction. Un rapport supérieur à 2 témoigne de la présence d’une quantité importante d’ARN. L’absorption à 270 nm permet de mettre en évidence une éventuelle contamination par le Phénol (25). Ainsi pour de l’ADN pur, l’appréciation de la quantité se fait par une lecture à 260 nm.
1D.O (à 260 nm) = 50 ng/µl pour le DNA double brin
1D.O (à 260 nm) = 40 ng/µl pour le DNA simple brin
– Par Fluorimétrie
On utilise une longueur d’onde d’excitation de 365 nm et d’émission de 460 nm. Cette technique est plus sensible que la spectrophotométrie. De plus, il est possible de travailler sur de faibles volumes (10µl). Cette méthode présente cependant un inconvénient : elle est sensible à la composition en bases (le fluorochrome se fixe préférentiellement sur les ADN riches en A et T). Le standard utilisé devra avoir une composition en GC proche de celle de l’ADN mesuré (les cellules eucaryotes ont une composition en GC de 39 à 46%, en moyenne, et les cellules procaryotes de 26 à 77%. Cette technique ne quantifie pas l’ARN.
– Par Minigel
Lorsqu’on ne dispose pas de DNA en quantité suffisante pour mesurer la D.O en U.V, une estimation sur minigel peut être effectuer (22). L’intensité de la tâche observée en U.V (après contact du Bet) est comparée à celle donnée par un DNA standard disposé en quantité connue.

Autres méthodes d’extraction d’ADN

L’emploi d’agents chaotropiques tels que l’iodure de Sodium (NaI) ou le thiocyanate de guanidium (GTC), suivi de précipitation par des alcools (éthanol, isopropanol), produit des acides nucléiques qui sont compatibles avec les techniques d’amplification génique.
– L’utilisation d’agents adsorbants ; en présence de GTC à forte concentration ; la Silice fixe l’ADN. L’usage des particules de verre et de certaines résines anioniques telles que le Chelex-100 à 20% (Biorad) aboutit à un résultat semblable. Après lavage, les acides nucléiques sont élués par un tampon de faible force ionique. Dans ces conditions, l’ADN obtenu a un grand degré de pureté, les agents contaminants étant éliminés au cours des étapes de lavage ;
– La capture sur des billes magnétiques ;
– L’ADN libéré par simple lyse des cellules à l’aide d’ultrasons peut être de qualité suffisante pour être amplifié ;
– Une simple ébullition est suffisante pour libérer les acides nucléiques et les rendre amplifiables par PCR (16).

Les acteurs de la PCR

– L’ADN généralement bicatenaire, contenant le fragment à amplifier,
– Deux amorces, sens et antisens choisies de façon à encadrer la séquence d’ADN à amplifier. En effet se sont de petits brins d’ADN d’environ 20 bases (appelées oligonucléotides) capables de s’hybrider de façon spécifique, grâce à la complémentarité des bases, sur le brin d’ADN ou son brin complémentaire (22)
– Une enzyme ; la Taq Polymérase (Taq Pol), est une ADN polymérase thermorésistante extraite de la bactérie Thermus aquaticus. En effet, elle est
capable de résister à des passages successifs à 95°C, ce qui a rendu possible l’automatisation de la procédure.
– Les 4 nucléotides ; dGTP , dATP , dCTP, dUTP appelés globalement dNTP (Désoxynucléotides Triphosphate), qui sont des éléments de base utilisés par la Taq pour synthétiser les brins complémentaires (13).

La Réaction

Une fois tous les acteurs de la PCR mis dans un tube, celui-ci est placé dans un thermocycleur automatisé (Minicycler, MjReseach). En effet, un total de 35 cycles est réalisé lors du processus d’amplification. Chaque cycle contient 3 phases:
– une phase de dénaturation : l’ADN contenant le segment à amplifier est chauffé à une température supérieure au melting temperature (Tm) (dans la pratique une température de 94°-95°C) pendant 30 secondes à 1 minute, en présence des composants nécessaires à la réplication. Ces brins serviront de matrice au cours des cycles d’amplification.
– une phase d’hybridation (ou annealing) faisant intervenir les deux primers pendant 30 secondes à 1 minute. Le milieu réactionnel contient deux amorces, chacune complémentaire d’un des brins. Celles-ci déterminent les bornes de la séquence à amplifier. Le milieu est amené, à une température inférieure à la température des amorces. Cette Tm, fonction de la séquence, est, en général, de l’ordre de 45 à 70 °C. Les amorces, en large excès, s’hybrident à tout ADN simple brin comportant la séquence complémentaire.
– une phase d’extension pendant 1 à 2 minutes :
La Taq polymerase allonge les amorces en y incorporant les désoxyribonucléotides complémentaires de la séquence de la matrice à laquelle elle est hybridée. La synthèse s’effectue dans le sens 5’—-3’ à 72°C, température optimale. A la fin du cycle, deux copies de la séquence d’ADN cible sont obtenues. Un nouveau brin d’ADN, dont la séquence est complémentaire de celle du brin cible, vient d’être synthétisé. En effet, que se passe t-il ? Le premier cycle a permis de synthétiser autant de brins complémentaires (plus courts puisque bornés par une amorce) que de brins cibles présents dans le tube. Ils deviennent à leur tour des ADNs cibles. Un nouveau cycle commence par l’étape de dénaturation, suivie successivement des étapes d’hybridation et d’extension. A chaque cycle correspond le doublement du nombre de copies de la séquence cible. Cette technique a évolué considérablement. De nouveaux types de PCR ont été introduits.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : Synthèse Bibliographique
Chapitre I : Généralités sur les Mycobactéries
I- Définition
II- Historique
III- Classification
IV- Caractères bactériologiques
IV.1- Morphologie
IV.2- Culture
IV.2.1- Culture sur milieu solide à l’oeuf
IV.2.2- Culture sur milieux gélosés
IV.2.3- Culture sur milieux liquides
IV.3- Biochimie
V- Epidémiologie
V.1- Dans le monde
V.2- En Afrique
VI- Diagnostic bactériologique
VI.1- Diagnostic direct
VI.1.1- Mise en évidence des bacilles
VI.1.1.1- Microscopie
VI.1.1.2- Culture
VI.1.1.3- Lecture
Chapitre II : Identification génotypique : la PCR
1- Définition
2- Principe
3- Réalisation pratique
3.1- Extraction de l’ADN
3.1.1- Extraction de l’ADN génomique ou chromosomique
3.1.2- Estimation des quantités d’ADN
3.1.3- Autres méthodes d’extraction d’ADN
3.2- Les acteurs de la PCR
3.3- La réaction
3.3.1- Optimisation de la PCR
3.3.2- Contamination
3.3.3- Application
3.4- PCR multiplex
3.4.1- Application
3.5- Autres types de PCR
4- Electrophorèse
DEUXIEME PARTIE : RESULTATS
Introduction
I- Validation de la PCR
vI.1- Matériel et méthodes pour la PCR
I.1.1- Matériel
I.1.1.1- Souches bactériennes
I.1.1.2- Matériel de laboratoire et réactifs
I.1.1.2.1-Verrerie
I.1.1.2.2- Réactifs de PCR
I.1.1.2.3- Milieu de culture
I.1.1.2.4- Appareillage
I.1.2- Méthodes
I.1.2.1- Isolement des souches
I.1.2.2- Préparation des échantillons à la PCR
I.1.2.2.1- Extraction de l’ADN
I.1.2.2.1.1- Extraction par le Kit InstaGene Matrix
I.1.2.2.1.2- Extraction par ébullition
I.1.2.2.2- Détermination du M.tuberculose du complexe tuberculosis
I.1.2.2.3- Détermination de l’espèce tuberculosis
I.1.2.2.3- Détermination du genre Mycobacterium
I.1.2.3- Analyse des produits PCR
I.2- Résultats et Discussion
I.2.1- Résultats
I.2.2- Discussion
II-Identification des souches nouvelles
II.1- Cadre d’étude
II.2- Matériel et méthodes pour la PCR
II.3- Résultats et Discussion
II.3.1- Résultats
II.3.2- Discussion
Conclusion
Bibliographie
Annexe