Méthodes d'évaluation de la génotoxicité des rayonnements ionisants

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Résultats immunohistochimique et discussion

Dans le cancer invasif du col utérin, le stade clinique est le paramètre le plus déterminant dans la prise en charge de la patiente. Cependant, selon le stade donné, d’autres variables peuvent influer sur le pronostic, telles que le volume de la tumeur, le degré de différenciation et l’envahissement de l’espace lymphovasculaire [105]. Plusieurs études ont montré des effets bénéfiques de la mise en évidence de ces différents biomarqueurs. Il est rapporté que le HIF-1 favorise la survie des cellules endothéliales après la radiothérapie en induisant l’expression de son gène en aval (le facteur de croissance des cellules endothéliales vasculaires) et entraîne ainsi la radiorésistance globale des tumeurs [105]. Dans une autre étude, l’expression de HIF-1 chez les patientes ayant subi une radiothérapie exclusive pour le cancer du col de l’utérus indique un risque accru de décès lié à la tumeur [182]. Il est donc nécessaire de trouver des indicateurs de pronostic plus spécifiques et accessibles en routine pour les pays en développement. Dans notre étude, nous avons examiné l’expression de plusieurs biomarqueurs dans les carcinomes invasifs du col utérin afin d’évaluer leur valeur en tant qu’indicateurs pronostiques. Pour ce faire, nous avons réalisé une étude prospective. Ainsi, soixante femmes sénégalaises âgées entre 37 – 58 ans, atteintes d’un carcinome invasif du col utérin en attente d’une radiothérapie, ont été incluses dans notre étude. Les données anatomopathologiques ont été recueillies à partir de la base des données du laboratoire d’anatomopathologie.
Au cours de l’étude immunohistochimique, nous avons adopté la technique T.MA suivi d’une coloration HE. Cette technique TMA, bénéficie régulièrement des progrès améliorant la sensibilité, la reproductibilité et elle permet également de valider des marqueurs biologiques.
Au total, nous avons analysé neuf lames de biopsies, dont deux ont été colorées à l’hématéine-éosine (au lieu des 513 lames). L’immunoréactivité des protéines HIF-1, VEGF, CAIX, Glut-1, CD8, p16, Ki67, Il6, Cox-2 a été quantifiée sur les tissus tumoraux à l’aide du logiciel Metafer 4 version 3.12.7. après scanning et matching de l’ensemble des carottes (figure 41).

Thématique N°2

Contexte scientifique

La radiothérapie est la pierre angulaire du traitement du cancer du col utérin localement avancé en association avec la chimiothérapie à base de sels de platine. Globalement le taux de contrôle local varie avec le stade du cancer, de plus de 95% au stade I à 60 à 85% pour le stade IV [184]. Cependant, 30 à 40% des patientes présentant des facteurs pronostiques similaires ne répondent pas de manière similaire à des traitements standards comparables [160]. Bien que le virus du papillome humain (HPV) ait été identifié comme étant un des facteurs à l’origine du cancer du col utérin, son rôle en tant qu’agent modulateur de la réponse au traitement n’est toujours pas clair. Certaines études ont montré que l’infection par le virus du papillome humain était associée à un meilleur pronostic du cancer du col utérin traité par radiothérapie [92]. Cependant, la limite était le nombre très limité de patientes. Dans les études pilotes, il a été montré que la persistance du virus du papillome humain après le traitement par radiothérapie était associée à des résultats médiocres avec une augmentation des récidives locales [208]. D’autres auteurs ont défendu l’idée que le génotypage du virus du papillome humain pourrait être un biomarqueur de la réponse et du pronostic chez les patientes subissant une chimioradiothérapie, car le HPV-16 [65] et 18 [8] ont été identifiés comme étant des facteurs prédictifs d’une réponse médiocre à la radiothérapie. Pour les autres types de HPV, l’absence de séquences d’ADN de HPV détectées serait associée à un mauvais pronostic Jusqu’à présent, les résultats sur l’impact clinique du virus du papillome humain et leur signification pronostique restent controversés. En effet, Lai et al. ont indiqué que l’évolution du traitement était favorable chez les patientes atteintes d’un carcinome cervical infecté par des types liés à HPV-58 [128]. Des études in vitro montrèrent que la présence de protéines E6 et E7 des HPV est corrélée à une radiosensibilité réduite [8]. Bachtiary et al. ont montré que L’incidence rapportée d’infection multiple par le HPV chez des patientes atteintes d’un cancer du col de l’utérus varie considérablement de 0% à 36%. En plus, les patientes présentant une multi- infection à HPV avaient un risque significativement plus élevé de progression de la maladie et une survie raccourcie que les patientes mono-infectées au HPV après radiothérapie [8]. Au vu de ces différents résultats, nous nous sommes fixés comme but dans notre présente étude de déterminer le lien entre l’infection par plusieurs types de HPV et la probabilité de réponse et de survie à la radiothérapie. Cela pourra aider les cliniciens à élaborer des stratégies thérapeutiques appropriées pour le sous-typage moléculaire des patientes présentant un risque élevé de récurrence de la maladie.

Résultats et discussion

Nous avons travaillé sur les biopsies des patientes sélectionnées conformément au protocole de la thématique N°1. L’ADN total du génome tumoral était extrait et amplifié selon la technique de PCR multiplex en utilisant les amorces MY09-MY11, GP5+ et GP6+. Ces sondes spécifiques permettaient de détecter les génotypes des HPV 6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73 et 82. La ß-globine était utilisée comme témoin interne. Les cas simultanément négatifs à l’HPV et à la ß-globine étaient considérés comme non satisfaisants et exclus de l’étude. Sur les 60 blocs examinés, l’extraction de l’ADN était non satisfaisante dans six cas. Une infection HPV-HR était présente dans tous les autres tumeurs. Il s’agissait d’une mono-infection dans 36 cas (70%) et d’une multi-infection dans 15 cas (30%). La multi-infection était double (n=11 ; 73,3%), triple (n=4 ; 26,7%). Au total, sur les 51 cas validés, 05 variants HPV-HR étaient identifiés par la technique de PCR-multiplex. L’HPV 16 et 18 représentait environ 80% de l’ensemble des HPV impliqués dans le cancer du col utérin (CCU) des femmes de cette étude. Chez 51 patientes, un HPV 16 ou 18 était au moins l’un des virus mis en cause. Dans les autres situations, le CCU était associé au minimum à un HPV 35, 45 ou 58. La présente étude est la première à montrer la distribution des génotypes du papillomavirus humain avant la RT chez des patientes sénégalaises atteints du cancer du col utérin. Bien que le nombre de patientes dans la présente étude soit faible, les résultats concordaient avec les données concernant l’incidence globale des génotypes du HPV dans les CCU [49]. En effet, la fréquence des infections multiples constatée dans notre étude est un phénomène courant et varie selon les études car liée à la méthode de détection du HPV. Globalement nous pouvons retenir que la multi-infection est fréquente chez nos patientes.

Table des matières

Avant-propos
Chapitre I: Introduction
I. Le cancer du col de l’utérus
I.1 Epidémiologie des cancers du col de l’utérus
I.2 Anatomie du col utérin
I.3 Biologie des cancers du col de l’utérus
I.3.1 Human Papilloma Virus: HPV
I.3.2 Carcinogénèse des papillomavirus humains
I.3.3 La prévention
I.4 La prise en charge thérapeutique
I.4.1 Indications de la radiothérapie
I.4.2 Dose totale et fractionnement
I.4.3 Techniques d’irradiation
II. Effets physiques des radiations ionisantes
II.1 L’étape physique
II.1.1 Interaction électrons-matière
II.1.2 Interactions photons-matière
II.2 Effets physico-chimiques
II.2.1 Effet physico-chimique direct
II.2.2 Effet physico-chimique indirect
III. Effets biologiques et dosimétrie biologique des radiations ionisantes
III.1 Effets direct et indirect des rayonnements ionisants.
III.2 Effets sur l’ADN
III.2.1 Dommages sur l’ADN
III.2.2 Systèmes de Réparations des lésions radio-induites
III.3. Arrêts du cycle cellulaire radio-induits
III. 3.1. Généralités et régulation du cycle cellulaire
III. 3.2. Arrêts du cycle cellulaire après irradiation.
III.4. Dosimétrie Biologique
III.4.1 Méthodes d’évaluation de la génotoxicité des rayonnements ionisants
III.4.1.1 Détection des lésions primaires de l’ADN
III.4.1.2 Détection des mutations
III.4.2 La radiosensibilité
III.4.2.1 L’hypersensibilité aux fortes doses de rayonnements ionisants
III.4.2.2 Hypersensibilité aux faibles doses de rayonnements ionisants
IV: Marqueurs de radioresistance
IV.1 Marqueur hypoxique: HIF1 α (Hypoxia Inductible Factor 1α)
IV.1.1 Structure
IV.1.2 Expression et régulation de HIF-1
IV.1.3 Mécanisme d’action
IV.1.4 Effets biologiques
IV.2 Marqueur angiogénique: VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)
IV.2.1 Structure
IV.2.2 Expression et régulation
IV.2.3 Mécanisme d’action
IV.2.4 Effets biologiques
IV.3 Marqueurs métaboliques
IV.3.1 CA IX (Anhydrase carbonique IX)
IV.3.1.1 Structure
IV.3.1.2 Expression et régulation
IV.3.1.3 Mécanisme d’action
IV.3.1.4 Effets biologiques
IV.3.2 Glucose transporter 1 : GLUT-1
IV.3.2.1 Expression et régulation
IV.3.2.2 Mécanisme d’action
VI.3.2.3 Effets biologiques
IV.4 Outils pour les études immunologiques des marqueurs de radiorésistance tumorale
IV.4.1. Principe de l’immunocytochimie
IV.4.2. Principe de l’immunohistochimie
V Contexte du travail de thèse
Chapitre II: Recherche de Biomarqueur, génotypage et dosimétrie biologique
I. Thématique N01: Recherche de biomarqueurs de radiorésistance sur la lignée cellulaire HeLa et sur des biopsies de cancer du col de l’utérus de femmes Sénégalaises en attente radiothérapie
I.1 Etude immunocytochimique
I.1.1 Biologie cellulaire
I.1.2 Culture et entretien de la lignée cellulaire
I.1.3 Irradiation cellulaire
I.1.4 Protocoles standards
I.2 Etude immunohistochimique
I.2.1 Population d’étude
I.2.2 Matériel et méthode
II. Thématique N02: Génotypage des HPV sur des biopsies de cancer de col de l’utérus chez des femmes sénégalaises en attente d’une radiothérapie
II.1 Population d’étude
II.2 Matériel et méthodes
II.2.1 Extraction de l’ADN
II.2.2 Génotypage Multiplex des HPV “Multiplex HPV Genotyping (MPG)”
II.2.3 Analyses statistiques
III. Thématique N°3: Etablissement de la courbe dose effet à partir de donneurs Africains
III.1 Population d’étude
III.2 Matériel et méthodes
III. 2.1 Procédure d’irradiation et mise en culture
III.2.2 Marquage des télomères et centromères
III.2.3 Expression des résultats
III.3 Les analyses statistiques
Chapitre III: Résultats et discussion
I. Thèmatique N°1
I.1 Résultats immunocytochimique et discussion
Article 1
Article 1: Determination of endogenous radioresistance markers on radio-resistant hela cells
I.2 Résultats immunohistochimique et discussion
II. Thématique N°2
II.1 Contexte scientifique
II.2 Résultats et discussion
Article 2
Article 2 : Genotypage HPV
III. Thèmatique N°3
III.1 Contexte scientifique
III.1 Résultats et discussion
Article 3
Biological dosimetry network in Africa: Establishment of a dose response curve using telomere and centromere staining
Chapitre IV: Conclusion Générale
Références bibliographiques