Effets de l’insuline et de la 20E sur la biochimie du corps gras

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Présentation du matériel biologique

Ephestia kuehniella (Zeller, 1877), insecte lépidoptère nocturne et holométabole, existe dans les régions tempérées et méditerranéennes (Balachowsky, 1972). Cet insecte est un ravageur des denrées stockées et cause des nuisances aux grains de céréales, biscuits, pâtes alimentaires, chocolat et riz; néanmoins, il montre une nette préférence pour la farine d’où son nom «Pyrale de la farine ». E. kuehniella est aussi une source d’allergène et peut donc provoquer de l’asthme et des rhinites (Bataille et al., 1995; Cipola et al., 1996). Parallèlement à son intérêt économique, E. kuehniella constitue, du fait de son élevage facile et de son cycle de développement court, un modèle biologique de laboratoire intéressant pour différentes études. Le développement chez E. kuehniella passe par 4 stades (Fig. 4) qui sont : œuf, larve ou chenille, nymphe ou chrysalide, adulte ou papillon (Balachowsky, 1972).
L’œuf, de couleur blanchâtre et de forme ovoïde, présente une longueur de 440 μm, et une largeur de 250 μm. Il est utilisé dans la lutte biologique comme aliment pour l’élevage des prédateurs naturels et présente de ce fait une valeur économique (Lynn & Ferkovich, 2004)
La larve, de couleur blanc rosé, mesure 9 à 15 mm de long. Dès l’éclosion, la larve s’alimentant directement, est caractérisée par un déplacement rapide et une vive activité de filage. Les larves du dernier stade débutent leur nymphose en tissant une enveloppe de soie ou « cocon » pour former la chrysalide. A ce stade, les mâles se différencient des femelles par la présence, sur la face dorsale, d’une tache sombre correspondant aux testicules.
La chrysalide, stade immobile où se produit la métamorphose, correspond à un cocon dans lequel la nymphe évoluera pendant 8 à 12 jours; ce cocon, de couleur brunâtre mesure environ 9 à 10 mm de long et devient de plus en plus foncé avec l’âge.
L’adulte, de couleur grise, mesure 10 à 12 mm d’envergure. Il est formé par deux paires d’ailes, deux ailes antérieures grisâtres avec des points noirs et deux ailes postérieures blanchâtres finement frangées. Les mâles meurent, en général, 1 à 3 jours après l’accouplement et les femelles 3 à 4 jours après la ponte. La femelle pond environ 100 à 200 œufs pendant une période de 3 jours.

Elevage en laboratoire

L’élevage est réalisé dans des bocaux en verre contenant de la farine et recouverts par un morceau de tulle. L’élevage est maintenu dans des conditions contrôlées de température et d’humidité (25°C et 70 % environ). Les larves du dernier stade récoltées à la surface du tulle, sont séparées en fonction de leur sexe, et déposées dans des boites en plastique contenant de la farine et du papier plissé pour la nymphose.
L’élevage est suivi quotidiennement et les chrysalides nouvellement exuviées (0 jour) sont utilisées pour l’expérimentation. Les nymphes sont datées en fonction de leur âge (jours) après l’exuviation nymphale. Dans les conditions de laboratoire, le développement nymphal est de 9 jours environ.

Présentation des hormones

L’insuline humaine est un peptide à 2 chaînes d’acides aminés : une chaîne A de 21 acides aminés et une chaîne B de 30 acides aminés liés par des liaisons peptidiques. Ces deux chaines sont reliées par 2 ponts disulfures mais, la chaine A comporte, aussi, 1 pont disulfure intrachaine ; tous les ponts disulfures sont reliés à des cystéines La formule chimique de l’insuline est C257H383N65O77S6 et la masse moléculaire de 5807 g/mol. (Fig. 5).
La 20 hydroxyecdysone est un stéroïde, provenant du cholestérol; cette hormone est caractérisée par un noyau stérol portant une jonction cis des cycles A et B, un chromophore 6-one-7-ène sur le cycle B et un hydroxyle en position 14. Sa formule chimique est C27H44O7 et la masse molaire de 480,64 g/mol (Fig. 6).

Traitements

La 20 hydroxyecdysone et l’insuline ont été administrées par application topique (Jeffers et al., 2014; Gu & Chow, 2003). Les doses de 5 et 10 µg ont été choisies en se basant sur la littérature (El-Ouaer et al. 2010, Roy et al. 2007); une quantité de 3µl a été déposée sur la face latéro-ventrale de l’abdomen des chrysalides nouvellement exuviées (< 6 h et sans cocon). Les séries témoins reçoivent 3µl de solvant (acétone). L’acétone permet une meilleure diffusion à travers la cuticule. L’insuline est soluble dans les solvants organiques (Brange, 1987) et sa solubilité dans l’acétone est cité dans la littérature (Bergeron et al., 2003). En outre, des études antérieures ont montré que chez E. kuehniella, l’acétone n’a pas d’effet significatif, comparativement aux séries traitées (El Ouar et al., 2006).
4.1. Traitement simple: La 20 hydroxyecdysone ou l’insuline ont été administrées, séparément, le jour de l’exuviation nymphale.
4.2. Traitement combiné: La 20E est appliquée le jour de l’exuviation nymphale (5 ou 10 µg) puis l’insuline (5 ou 10 µg) à deux périodes différentes du stade nymphal (3 ou 5 jours); ces deux temps correspondent respectivement à la phase ascendante et descendante du pic des ecdystéroïdes coïncidant avec la vitellogénèse (El-Ouaer et al. 2010).
Figure 5. Structure chimique de l’insuline humaine. Photo : www.jle.com

Extraction et dosage des métabolites dans le corps gras.

Les corps gras des chrysalides femelles témoins et traitées d’E. kuehniella, prélevés à 0, 1, 3, 5 et 7 jours ont été pesés puis conservés au froid (-20°C) dans 300 µL d’acide trichloracétique (TCA à 20% d’eau distillée) jusqu’à leur analyse (Fig. 7).
L’extraction des sucres totaux, protéines et lipides a été réalisée selon le procédé de Schibko et al. (1966), et celle du glycogène selon Van Handel (1965).
Le dosage du glycogène et des sucres totaux a été effectué selon Duchateau & Florkin (1959) qui utilise, l’anthrone1 comme réactif et une solution mère de glycogène (0,1 mg/ml d’eau distillée) ou de glucose (1mg/ml d’eau distillée) comme standard (Tab. 1 et 2). Les absorbances ont été lues à 620nm.
La quantification des protéines a été réalisée selon la méthode de Bradford (1976) qui utilise le bleu brillant de Comassie2 (G250, Merck) comme réactif, et l’albumine de sérum de bœuf (BSA, Sigma) comme standard à (1 mg/ml) (Tab. 3). Les absorbances ont été lues à une longueur d’onde de 595nm.
Les lipides ont été déterminés selon la méthode de Glodsworthy et al. (1972) utilisant la vanilline3 comme réactif et une solution mère de lipides4 (2,5 mg/ml) comme standard (Tab. 4). Les absorbances ont été lues après 30 minutes à une longueur d’onde de 530 nm.
Tous les dosages ont été effectués sur des fractions aliquotes de 100 µl et les contenus des différents métabolites du corps gras ont été quantifiés grâces aux équations des droites de régression déterminées à partir des courbes de références. Les expérimentations sont conduites avec 6 à 8 répétitions par âge pour chaque série.

Dosage des ecdystéroïdes ovariens

Les ovaires des adultes femelles, nouvellement émergées (0j), des séries témoins et traitées, sont prélevés pesés puis additionnés de 500µl de méthanol (permet aussi l’extraction des ecdystéroïdes). Les échantillons sont ensuite conservés au froid (-20°C) jusqu’au dosage. Avant le dosage, les échantillons sont broyés puis centrifugés (2700 tours/min pendant 10 minutes); le surnageant est ensuite récupéré puis évaporé dans un bain à sec; les extraits secs (correspondant aux ecdystéroïdes libres) sont alors récupérés dans 500µl de tampon phosphate (pH : 7,4 ; 0,1M)1 préalablement préparé.
Les ecdystéroïdes libres ovariens ont été dosés selon la technique immunoenzyamatique ou EIA (De Reggi et al., 1992 ; Aribi et al., 1997). Cette dernière repose sur le principe de la compétition entre le traceur enzymatique qui est la peroxydase couplée à la 2-succinyl 20 hydroxyecdysone et les ecdystéroïdes des extraits biologiques pour les sites limités d’un anticorps anti-ecdystéroïdes. Les complexes formés seront ensuite fixés par un second anticorps (anti-immunoglobuline ou anti-IgG) de lapin (EIA polyclonal), déposés préalablement au cours d’un coating au fond des puits des microplaques à 96 puits (NUNC Immunoplate Maxisorp F96, Danemark). Au bout de 3 heures d’incubation, les éléments non retenus seront éliminés au cours d’un rinçage des plaques par un tampon de lavage2. La révélation ou la coloration est réalisée grâce à un réactif de la peroxydase qui est la tétraméthylbenzidine ou TMB (Sigma France). Cette étape se fait sous agitation pendant 15 à 30 minutes et les densités optiques sont mesurées à l’aide d’un lecteur de plaque (labsystem, Finlande) à 630 nm ou 450 nm sans ou avec addition d’H2SO4 (2N), respectivement. La coloration est inversement proportionnelle à la quantité d’ecdystéroïdes contenue dans les échantillons. Les résultats sont exprimés en picogrammes équivalent 20-hydroxyecdysone (pg équiv. 20E). Les résultats sont calculés à partir d’une courbe étalon, établie grâce à différentes concentrations de 20E (10-7M à 10-13M), réalisées à partir d’une solution mère (10-6M). Six à huit répétitions, pour chaque série, sont analysées individuellement. Le calcul des quantités d’ecdystéroïdes se fait grâce à la formule suivante :
B/B0 (%) = (B-T) / (B0-T) × 100
B : Absorbance de l’échantillon ou du standard.
B0 : Absorbance en absence de l’hormone (témoin ou tampon phosphate).
T : Absorbance en absence d’hormone et d’anticorps (blanc).
1 : 100 ml tampon phosphate; 23,4g Na Cl 0,4 M; 0,37g EDTA (Ethylène diamine tétra acétique acide); 1g BSA (sérum albumine bovine) complété avec à 1 L d’eau distillée.
2 : 5 ml solution mère, 250 ml Tween 20, Compléter à 500 ml avec de l’eau distillé.
Tableau 5. Analyse quantitative des ecdystéroïdes ovariens chez les adultes femelles d’E kuehniella traitées à l’insuline (5, 10µg) et à la 20E (5, 10µg) : courbe de référence établie avec un anticorps polyclonal (B de lapin) et exprimant B/B0 en fonction des concentrations molaires (M) de 20-hydroxyecdysone (20E).

Extraction et dosage des vitellogenines et des vitellines

Pour le dosage des vitellogénines, les corps gras ont été prélevés à partir des chrysalides femelles, à différents âges (0, 1, 3, 5 et 7j), des séries témoins et traitées. Pour le dosage des vitellines, les ovaires des adultes femelles, nouvellement émergées (0 jour), des séries témoins et traitées, sont disséquées puis prélevés. Les échantillons biologiques sont pesés puis conservés dans un tampon Tris-HCL-NaCl (pH 7,4). L’extraction des vitellogénines et vitellines, est effectuée selon Postlethwait et al., (1980) et Fabre et al., (1990). Les échantillons sont extraits après une homogénéisation dans le tampon Tris-HCl1 puis une centrifugation à 5000 tours/mn pendant 10 minutes. Le dosage des vitellogénines et des vitellines (en fonction des échantillons) a été réalisé selon la méthode de Bradford (1976) explicitée plus haut (voir 2.5). Les résultats sont exprimés en µg/mg de tissu. Les expérimentations sont conduites avec 6 à 8 répétitions par âge pour chaque série.

Détermination du potentiel reproducteur

Les adultes femelles, nouvellement émergées, provenant des chrysalides d’E. kuehniella, traitées séparément aux deux doses (5, 10 µg) de 20E ou d’insuline, sont accouplées avec des mâles non traités. Les différentes séries de couples sont maintenues dans des conditions contrôlées et un suivi régulier a permis de déterminer la
• durée de la période de préoviposition: nombre de jours entre l’émergence et le début de la ponte.
• durée de la période d’oviposition ou durée (en jours) de la ponte.
• fécondité des femelles: nombre total d’œufs pondus par femelle
• viabilité des œufs ou pourcentage d’éclosion: nombre d’œufs éclos sur le nombre total d’œufs pondus par femelle.

Dosage de la catalase

Les chrysalides mâles et femelles, des séries témoins et traitées sont broyées dans 1 ml de tampon phosphate (100 mM, pH 7). L’homogénat obtenu est centrifugé à 15000 tours pendant 15 min et le surnageant récupéré servira comme source d’enzyme.
L’activité de la Catalase (CAT) est déterminée selon la méthode de Claiborne et al., 1985. Elle est basée sur la mesure des absorbances après la réduction de H2O2. Le dosage est effectué sur 50µl de surnageant auquel on ajoute 750µl de tampon phosphate (100mM, pH 7,4) et 200 µl d’eau oxygénée H2O2 (500mM). La lecture des absorbances s’effectue toutes les 5 secondes pendant 30 secondes à une longueur d’onde de 240 nm dans un spectrophotomètre UV contre un blanc préparé avec 800µl de tampon phosphate (100mM, pH 7,4) et 200µl d’eau oxygénée H2O2 (500mM). La concentration en protéines totales des différents échantillons a été préalablement déterminée suivant la méthode de Bradford (voir la section 2.5). Les expérimentations sont conduites avec 6 à 8 répétitions par âge pour chaque série. L’activité spécifique est déterminée selon la formule suivante :
CAT (M/min/mg de protéines) = Δ D0 /min 0,043× mg de protéines
Δ D0 = Δ D0 /mn (blanc) – Δ D0 /mn (Echantillon)
0,043 Mol -1 : coefficient d’extinction molaire du peroxyde d’hydrogène.
Mg de protéines : quantité de protéines
Les résultats obtenus dans ce travail sont exprimés en µM/min/mg de protéines

Analyse statistique

Les résultats sont exprimés par la moyenne des différentes répétitions et leur écart type (m ± S. D). Pour toutes les séries de données et avant l’utilisation de tests paramétriques, l’égalité des variances a été confirmée grâce au test de Levene. Les données ont été analysées avec le test t de Student mais aussi avec des analyses de variance à un ou deux critères de classification (au seuil de 5%); le test post-hoc de Tuckey (test HSD) a permis le classement des différents effets. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant GraphPad prisme version 6.01 (GraphPad software, www.Graphpad.com).

Table des matières

INTRODUCTION
MATERIEL ET METHODES
1. Présentation du matériel biologique
2. Elevage en laboratoire
3. Présentation des hormones
4. Traitement
4. 1.Traitement simple
4. 2. Traitement combiné
5. Extraction et dosage des métabolites dans le corps gras
6. Dosage des ecdystéroïdes ovariens
7. Extraction et dosage des vitellogenines et des vitellines
8. Détermination du potentiel reproducteur
9. Dosage de la catalase
10. Analyse statistique
RESULTATS
1. Effets de l’insuline et de la 20E sur la biochimie du corps gras
1. 1 Contenu en carbohydrates
1. 1. 1. Effets de l’Insuline
1. 1. 2. Effets de la 20E
1. 1. 3. Comparaison des effets de l’insuline et de la 20E sur le contenu en carbohydrates
1. 2. Contenu en glycogène
1. 2. 1. Effets de l’Insuline
1. 2. 2. Effets de la 20E
1. 2. 3. Comparaison des effets de l’insuline et de la 20E sur le contenu en glycogène
1. 3. Contenu en protéines
1. 3. 1. Effets de l’Insuline
1. 3. 2. Effets de la 20E
1. 3. 3. Comparaison des effets de l’insuline et de la 20E sur le contenu en protéines
1. 4. Contenu en lipides
1. 4. 1. Effets de l’Insuline
1. 4. 2. Effets de la 20E
1. 4. 3. Comparaison des effets de l’insuline et de la 20E sur le contenu en lipides
2. Effets de l’insuline et de la 20E sur la reproduction
2.1. Effets de la 20E et de l’insuline en traitement simple sur les vitéllogénines dans le corps gras
2. 1. 1. Effets de l’insuline
2. 1. 2. Effets de la 20E
2. 1. 3. Comparaison des effets de l’insuline et de la 20E sur les vitellogenines
2. 2. Effets de la 20E et l’insuline en traitement combiné sur les Vitellogénines
2. 3. Effets de la 20E et de l’insuline en traitement simple sur les vitellines dans les ovaires
2. 3. 1. Effets de l’insuline
2. 3. 2. Effets de la 20E
2. 3. 3. Comparaison des effets de l’insuline et de la 20E sur le contenu en vitellines dans les ovaires
2. 4. Effets de la 20E et de l’insuline en traitement combiné sur les vitellines ovariennes
2. 5. Effets de l’insuline et de la 20E sur les ecdystéroïdes ovariens
2. 5. 1. Effets de l’insuline
2. 5. 2. Effets de la 20E
2. 5. 3. La comparaison des effets de l’insuline et la 20E sur les ecdystéroïdes ovariens
2. 6. Potentiel reproducteur
2. 6. 1. Effets de l’insuline et de la 20 E sur la période de Préoviposition
2. 6. 2. Effets de l’insuline et de la 20 E sur la période d’oviposition
2. 6. 3. Effets de l’insuline et de la 20 E sur la fécondité
2. 6. 4. Effets de l’insuline et de la 20 E sur le pourcentage d’éclosion
2. 6. 5. Comparaison des effets de l’insuline et de la 20E sur le potentiel reproducteur
Périoded’oviposition
Fécondité
Fertilité
3. Effets de l’insuline et de la 20E sur le stress oxydatif chez les mâles et les femellesd’E. Kuehniella
3. 1. Effets de l’insuline chez les femelles
3. 2. Effets de la 20E chez les femelles
3. 3. Comparaison de l’effet de l’insuline et de la 20E sur le stress oxydatif chez les femelles
3. 4. Effets de l’insuline chez les mâles
3. 5. Effets de la 20E chez les mâles
3. 6. Comparaison de l’effet de l’insuline et de la 20E sur l’activité spécifique de la catalase chez les mâles
DISCUSSION
1. Effets de l’insuline et de la 20E sur les principaux constituants biochimiques du corps gras
2. Effets de l’insuline et de la 20E sur la reproduction
3. Effets de l’insuline et de la 20E sur l’activité de la catalase
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
RESUMES
Français
Anglais
Arabe
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE : PRODUCTION SCIENTIFIQUE (publication et communications)