Protocole d’obturation nasale

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Protocole d’obturation nasale :

Anesthésie :

afin de pouvoir manipuler les jeunes ratons et réaliser une obturation nasale bilatérale sans aucun danger, les rongeurs ont été anesthésiés à l’éther dans des cloches en verre, le rat est placé à l’intérieur pendant quelques secondes. Cette procédure est indiquée pour les anesthésies de courte durée chez les rongeurs nouveau-nés.

Obturation nasale :

Les animaux anesthésiés sont soumis à une cautérisation bilatérale des narines externes selon le protocole de Meisami (1976). Il s’agit de la procédure la plus simple et la plus utilisée pour produire une obturation nasale réversible chez des animaux en croissance. Les narines sont brûlées à l’aide d’un instrument de cautérisation chirurgical (1 mm de diamètre) puis une pommade antiseptique à usage local (Auréomycine Evans dermique 3%) est appliquée sur la brûlure de façon à proscrire tout risque d’infection. Au cours de la cicatrisation, une fine membrane se forme et occlue l’orifice de la narine empêchant ainsi le flux d’air de passer.

Constitution des lots expérimentaux :

Au cours du 8ème jour postnatal (J8), les portées sont réparties aléatoirement en trois lots expérimentaux :
• Groupe obturation nasale (ON) (n=30): Les animaux anesthésiés sont soumis à une cautérisation bilatérale des narines
• Groupe contrôle (C) (n=16): les ratons anesthésiés sont brûlés en plaçant l’instrument de cautérisation 1-2 mm au dessus de chaque narine. Ce groupe expérimental est constitué afin de caractériser le traumatisme potentiel engendré par l’anesthésie et la cautérisation.
Obturation nasale et impact du lobe olfactif sur les réponses adaptatives et comportementales chez le rat Wistar
• Groupe témoin (T) (n=16) : les jeunes ne subissent aucune manipulation.
Après ces différentes opérations, les portées contrôle et obturation nasale sont rendues à leurs mères respectives.

Suivi des portées :

Du 8ème au 21ème jour post-natal, les jeunes sont observés au quotidien afin de noter :
• Le gain de poids, exprimé en g, représente la différence entre le poids final et le poids initial des animaux. Le gain de poids permet l’évaluation des performances de croissance. Le gain de poids (GP) (g) a été calculé comme suit: [Poids final (g) – Poids initial (g)].
• La date exacte de réouverture des narines des lots ON (n=16). Ce contrôle est effectué à l’aide d’une solution d’eau savonneuse. La solution est appliquée avec un coton sur les narines des animaux exposés à l’obturation nasale. Lorsqu’il y a apparition de bulles d’air, les narines sont considérées ouvertes et l’obturation nasale achevée.
• Le taux de mortalité dans chacun des lots expérimentaux.

Etude comportementale :

Test du labyrinthe en croix (plus maze) :

Dans le test, chaque raton était initialement positionné au centre du labyrinthe situé à l’intersection des quatre bras, la tête orientée vers l’un des bras ouverts (BO); il avait libre accès aux quatre bras pendant une durée de 5 min. Le labyrinthe était disposé dans une pièce isolée du bruit. L’expérimentateur visualisait le comportement du rat de l’extérieur de la pièce, grâce à une caméra vidéo ; il relevait les nombres de visites et temps passés respectivement dans les BO et dans les bras fermé (BF); une visite était comptabilisée lorsque le rat avait les quatre pattes à l’intérieur de l’un des deux dispositifs (BO ou BF). Les résultats ont été exprimés en :
Obturation nasale et impact du lobe olfactif sur les réponses adaptatives et comportementales chez le rat Wistar
• Temps passés (s) dans les bras ouverts (BO) et bras fermés (BF).
• Temps passés (s) dans le centre.
• Nombre de redressements.
• Nombre de défécations.
Ce test est un indice de l’état émotionnel du rat Wistar.
Figure 1 : Dispositif utilisé dans le test du labyrinthe en croix surélevée (plus maze).

Test du champ ouvert (l’open-field) :

Ce test est un dispositif comprenant une large boîte rectangulaire ouverte (90 cm x, 70 cm x, et 60 cm x), à fond blanc, et fortement éclairée du dessus (500 lux). Des lignes noires au sol délimitaient des carreaux (10 x 10 cm) (Dauge et al., 1989). C’est le plus courant. Il consiste à placer l’animal dans un environnement nouveau inconnu, pauvre en stimulation, ne comportant aucune possibilité d’abri ou de fuite.
L’animal est alors en situation d’isolement social, ce qui représente déjà une situation de stress,
ou en situation aversive. Le premier à l’avoir utilisé est Hall en1934.
Chaque rat était initialement placé dans un des quatre coins de l’Open-Field, la tête orientée vers le coin. Son comportement était observé pendant 5 minutes. Cinq paramètres étaient mesurés par l’expérimentateur :
• Temps passé dans le centre exprimé en secondes.
• Temps passé dans la périphérie exprimé en secondes.
• Temps passé dans la bordure exprimé en secondes.
• Nombre de redressements.
• Le nombre de défécations.
Ainsi, ce test évalue les capacités exploratoires du rat dans un contexte stressant. Le nombre de redressements reflètent son activité exploratoire et son état émotionnel.
Figure 2: Enceinte utilisée dans le test de champ ouvert (l’open –Field).

Evaluation de la reconnaissance olfactive :

Ce test nous permet d’apprécier la reconnaissance olfactive de l’environnement directe des animaux à J9, J15 et J21. Afin d’évaluer la capacité des individus à reconnaître et à s’orienter vers les odeurs familières, nous avons constitué deux types de sciure : l’une propre (SP) et l’autre ayant été utilisée dans un nid (SN).
Les ratons sont soumis à l’odeur provenant d’une enceinte expérimentale dont le sol est recouvert de sciure propre. L’autre enceinte contient la sciure imprégnée d’urine et de fèces maternels prélevée dans la cage d’élevage 5 min avant le début du test. Les enceintes expérimentales sont placées de façon aléatoire d’un côté ou de l’autre du labyrinthe. Le labyrinthe est brièvement nettoyé à l’alcool à 70° puis laissé à sécher durant le passage de deux individus (8 min environ).
Les différents paramètres sont pris en compte :
-Le temps de latence, temps nécessaire avant d’effectuer le 1er choix.
-Le temps passé dans chaque type de sciures.
Figure 3 : Dispositif expérimental utilisé pour mesurer la reconnaissance olfactive.

Prélèvements des extraits biologiques :

Après ces différentes opérations, les rats sont sacrifiés à J9, d’autres à J15 et ceux qui restent à J21, pesés puis disséqués rapidement. Différents extraits biologiques sont prélevés sur chacun des individus :
Les prélèvements sanguins sont effectués dans des tubes EDTA pour faire l’analyse de FNS, la glycémie est mesurée immédiatement avec un glucomètre. Le sang prélevé sous héparine est centrifugé à 1480 tours/min, pendant 10 minutes, pour obtenir le sérum. Celui-ci a été conservé à -20 ° C jusqu’à la réalisation des dosages hormonaux. La comparaison se fera pour tous les paramètres dosés versus les groupes contrôles et témoins.
Après dissection du cerveau de l’animal, on le place dans une balance de précision afin de déterminer sa masse.

Analyses statistiques :

L’analyse des résultats a été réalisée à l’aide du logiciel XLSTAT 2014 et Minitab17. Pour chacun des facteurs expérimentaux (comportementaux et biologiques), les résultats ont été traités par une analyse de variance (ANOVA) à deux et/ou à un facteur(s), les facteurs pouvant varier selon le test, mais le facteur obturation nasale (ON) étant toujours présent. Quoi qu’il en soit, dans la description des résultats de chaque test, le/les facteur(s) impliqué(s) sera/seront précisé(s), de même que le facteur F de l’analyse de variance, et le degré de significativité (noté p) y correspondant. Dans tous les cas, le seuil de significativité (p) a été fixé à 5% ; sur les figures, cette significativité a été représentée par une étoile lorsque la significativité était inférieure ou égale à 5% (p≤0,05), par deux étoiles lorsqu’elle était inférieure ou égale à 1% (p≤0,01), et par trois étoiles lorsqu’elle était inférieure ou égale à 0,1% (p≤0,001). Lorsque le degré de significativité était supérieur à 0,05, les résultats ont été considérés comme non significatifs (noté ns dans les tableaux).

RESULTATS

Comportement des rats après l’obturation nasale :

Au réveil de l’anesthésie, les rats obturés tentent avec leurs pattes antérieures, d’ouvrir leurs narines, mais en vain la cautérisation semble réussie. On remarque les signes cliniques suivants : Rythme cardiaque accéléré; respiration buccale, perte d’équilibre, agitation suivie d’une diminution de la mobilité, poils piqués. Le taux de mortalité des animaux exposés à l’obturation nasale, est présenté sous forme cumulée dans la figure 4, La majorité des jeunes meurent le 10ème jour postnatal, soit 48h après la cautérisation des narines. À cet âge, le taux de mortalité cumulé est de 25% chez les femelles et de 28.571% chez les mâles. La mortalité augmente ensuite progressivement jusqu’au 13ème jour postnatal chez les mâles et jusqu’au 14ème jour postnatal chez les femelles avant de se stabiliser. Le 21ème jour postnatal, le taux de mortalité cumulé est de 56.25% chez les femelles et de 57.143% chez les mâles. Quel que soit l’âge considéré, il n’y a aucune différence significative entre les femelles et les mâles exposés à l’obturation nasale (p=0.014). À noter qu’aucune mortalité n’a été observée dans les lots témoins et contrôles au cours de la période d’observation.

Croissance pondérale :

Nos résultats montrent que la croissance pondérale des individus diffère significativement en fonction du groupe expérimental (F =17,92, p < 0,0001).
En effet, les animaux exposés à l’obturation nasale présentent une masse pondérale significativement plus faible à J15 que ce soit chez les femelles (p = 0,000 vs témoins; p = 0,001 vs contrôles) ou chez les mâles (p = 0,001 vs témoins; p = 0,004 vs contrôles). Cette disparité est reliée à une différence significative au niveau du gain pondéral sur la période J9 – J15 (F =18,97, p < 0,0001). Les individus exposés à l’obturation nasale présentent ainsi un gain pondéral amoindri par rapport aux animaux témoins (p < 0,0001 chez les femelles; p < 0,0001 chez les mâles) et contrôles (p < 0,0001 chez les femelles; p < 0,0001 chez les mâles).
À l’inverse, aucune différence significative n’est observée en ce qui concerne le gain pondéral au cours de la période J15 – J21 (F = 1,87, p = 0,33).
Figure 5 : Croissance pondérale (g) et gain pondéral (g) des animaux témoins, contrôles et obturation nasale entre le 9ème et le 21ème jour postnatal.

Paramètres comportementaux :

Open Field (test de champs ouvert) :

Temps passé au centre du dispositif :

D’après nos résultats on remarque que dans l’open Field, les rats passent moins de temps dans la zone centrale, les rats ON passent en moyenne à J9 (3,231±1,223) avec un maximum 4,16 s et un minimum de 1,50 s pour les mâles et pour les femelles (2,33±0,582) avec un maximum 6,795 s et un minimum de 0,528 s, les rats contrôles passent en moyenne (4,211 ±2,087) avec un maximum de 7,451 s et un minimum de 0,10 s pour les rats mâles et pour les femelles (1,789±1,685) avec un maximum de 3,859s et un minimum de 0,665s et pour les lots témoins mâles la moyenne est de (3,62±1,212) avec un maximum de 4.1 s et un minimum de 1,05 s et pour les femelles (2,185 ±0,491) avec un maximum de 3,651 s et un minimum de 1,825 s . L’analyse statistique montre qu’il n’ya pas de différence significative à J9, J15 et J21 entre les trois valeurs (F=3,645 et P=0,114) ceci représente un signe de moindre anxiété.

Temps passé à la périphérie du dispositif :

Nous avons constaté que d’une session à l’autre les rats ON, contrôles et témoins passent quasiment le même temps dans la partie périphérique, représentées en moyenne de (5,473 ±2,11) pour les rats ON mâles et (17,475±1,984) pour les femelles, de (8,524±3,22) pour les rats contrôles mâles et (15.485±2,365) pour les femelles. Les rats témoins passent en moyenne (4,56±1,859) pour les mâles et (18,27±0,921) pour les femelles. L’analyse statistique montre qu’il n’y a aucune différence significative entre les trois valeurs à J9 (F=14,87 ; P=0,31), à J15 (F=21,44 ; P=0,22) et à J21 (F=23,97 ; P=0,11).
Figure 7 : Temps (s) passé à la périphérie du dispositif Open Field pour les rats ON, contrôles et témoins.

Temps passé à la bordure du dispositif :

Au niveau du temps passé à la bordure du dispositif, on remarque qu’il n’y a aucune différence significative quelque soit le groupe, le sexe et l’âge des rats, (F=4,857 ; P=0,211) à J9, (F=6,598 ; P=0,320) à J15 et (F=4,354 ; P=0,149) à J21 pour les mâles et pour ce qui est des femelles à J9 (F=4,857 ; P=0,065) , à J15 (F=3,54 ; P=0,19) et (F=3,698; P=0,047) à J21.
Figure 8 : Temps (s) passé à la bordure du dispositif Open Field pour les rats ON, contrôles et témoins.

Redressements et défécations :

Le nombre de redressements et de défécations dans le dispositif Open Field est représenté dans la figure 9, les valeurs affichées représentent la moyenne. On constate des differences hautement significatives entre les lots expérimentaux pour le nombre de redressements à J9 (F= 7,94, P <0,0001) pour les mâles et (F= 7,35, P <0,0001) pour les femelles. Quelque soit le sexe, Il n’y a en revanche aucune différence significative pour le nombre de redressements dans le dispositif à J15 et J21.
Pour le nombre de défécations, on enregistre des différences significatives entre les rats mâles traités, contrôles et témoins quoi qu’ils soient leur âge à J9 (F= , P<0,0001), à J15 (F= , P=0,03) et à J21 (F=, P=0,014)

Table des matières

INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
1. Matériel biologique
1.1. Modèle animal
1.2. Conditions d’élevage
2. Méthodes
2.1. Protocole d’obturation nasale
2.1.1. Anesthésie
2.2.2. Obturation nasale
2.2. Constitution des lots expérimentaux
2.3. Suivi des portées
2.4. Etude comportementale
2.4.1. Test du labyrinthe en croix (plus maze)
2.4.2 Test du champ ouvert (l’open-field)
2.5. Evaluation de la reconnaissance olfactive
2.6. Prélèvements des extraits biologiques
2.7. Analyses statistiques
RESULTATS
1. Comportement des rats après l’obturation nasale
1.1. Croissance pondérale
2. Paramètres comportementaux
2.1. Open Field (test de champs ouvert)
a) Temps passé au centre du dispositif
b) Temps passé à la périphérie du dispositif
c) Temps passé à la bordure du dispositif
d) Redressements et défécations
2.2.Plus Maze ( test de croix surélevée)
a) Temps passé au centre du dispositif
b) Temps passé dans les bras fermés du dispositif
c) Temps passé dans les bras ouverts du dispositif
d) Redressements et défécation
DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUE