Effet de l’indoxacarbe sur la morphométrie des ovaires

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Présentation de l’insecte :

B. germanica (Linnaeus, 1767) de l’ordre des Dictyoptères et de famille des Blattellidae (Guillaumin et al., 1969), est une espèce domestique prédominante (Miler & Kochle, 2003), cosmopolite (Gordon, 1996), nocturne, ovipare à développement hétérométabole (Guillaumin et al., 1969). Le corps des adultes est mou aplati dorso-ventrale mesurant 11 à 12 mm de longueur avec une tête qui porte de longues et fines antennes (Gordon, 1996), un thorax et un abdomen bien visible. Les pièces buccales sont du type broyeur « classique », en position hypognathe (orienté vers le bas). Les pattes sont longues et épineuses et munies de coxae larges et aplaties, bien adaptées à la course (vitesse de 130 cm par seconde). B. germanica peut facilement grimper sur des surfaces verticales rugueuses ou polies (Wigglesworth, 1972); (Bell et al., 2007). Sa couleur varie de brun pâle à noire; le pronotum porte deux bandes longitudinales de couleur noire. Les Adultes femelles de cette espèce sont de couleur plus sombre et possèdent un corps trapu et robuste avec un abdomen arrondi complètement recouvert par les ailes, alors que les mâles présentent un corps mince, un abdomen effilé et un pygidium non recouvert par les ailes laissant visible le segment terminal de l’abdomen (Rust et al., 1995). Les larves ressemblent aux adultes à l’exception des ailes absentes. Les blattes copulent en opposition. L’appareil copulateur mâle est asymétrique et très compliqué (Fig. 1)

Cycle biologique de B. germanica

La femelle, dont la longévité est de 158 jours (Cornwell, 1968), produit généralement entre 6 à 8 oothèques, chaque oothèque de 8 mm de long contient 36 à 48 œufs, sont déposées près d’une source de nourriture peu avant l’éclosion (Tanaka, 1976 ; Gordon, 1996). Le temps d’incubation des œufs dépend des conditions extérieures. Dans les conditions de température les plus favorables (30°C environ) la durée de l’évolution embryonnaire est d’environ 17 jours pour donner des larves mous, de couleur blanchâtre après tannage de la cuticule en quelques heures, prennent une couleur brunâtre (Fig. 2 et 3). Les Larves du dernier stade subissent alors une mue imaginale donnant l’adulte en une centaine de jours (Cornwell, 1968; Wattiez et Beys, 1999). La durée du développement du dernier stade larvaire est de 41jours chez la femelle et de 40 jours chez le mâle.
Figure2: Cycle biologique de Blattella germanica à T= 30°C (Cornwell, 1968).
Hutchinson, 1999) (1: Oothèque, 2 à 6: Stades Larvaires, 7: Femelle adulte, 8: Mâle Adulte).
Le stade œuf : Il commence à la fertilisation des œufs et se termine à l’éclosion. Les œufs sont réunis dans une capsule de consistance cornée appelée oothèque qui se forme et arrive à faire saillie à l’extérieur pendant la ponte (Tanaka, 1976). De forme et de taille variable, l’oothèque possède sur la face dorsale une crête dentriculée au niveau de laquelle se fera l’éclosion. Les œufs sont disposés verticalement de chaque côté d’une cloison médiane qui divise l’oothèque dans le sens de la longueur (Tanaka, 1976) (Fig.3 (1)).
Le stade larvaire : la femelle dépose l’oothèque, peu avant l’éclosion et des larves vermiformes en sortent. Les principaux changements du développement larvaire s’effectuent au niveau de la taille et la pigmentation; les larves de dernier stade ressemblent aux adultes mais sont aptères (Rust et al., 1995 ; Elie, 1998) (Fig. 3(1-6)).
Le stade adulte: commence à la mue imaginale (adulte 0 jour). L’adulte possède alors 2 paires d’ailes, des antennes longues et filiformes, des pattes robustes et épineuses permettant une course rapide et des pièces buccales broyeuses (Wigglesworth, 1972). Les adultes mâles possèdent un corps mince, à abdomen effilé et un pygidium non recouvert par les ailes; les femelles de couleur plus sombre présentent un corps trapu et robuste avec un abdomen arrondi recouvert par les ailes (Rust et al., 1995) (Fig. 3 (7-9)).

Elevage des Blattes :

Des prélèvements ont été réalisés à l’hôpital Ibn Rochd au niveau de la résidence universitaire 2000 Chaiba (Annaba), ainsi que dans différentes maisons et dans certains fast-foods et boulangeries. La capture des blattes a été réalisée manuellement, elle a été faite en plaçant des pièges dans les coins là où les blattes sont généralement les plus abondantes. Les pièges sont, soit des bouteilles en plastique dans lesquelles on met des attractifs alimentaires (pomme, des biscuits ou des morceaux de pain), soit des cartons pliés sous lesquels les blattes s’abritent (Fig. 4). Les pièges sont récoltés une fois par semaine.
Figure 4: Les pièges utilisés pour la capture des blattes en milieu urbain (photo Personnelle). L’élevage au laboratoire s’effectue dans des boites en plastique aérées contenant des emballages alvéolés d’œufs qui servent d’abris. Les Blattes sont nourries de biscuits pour chien, dont la composition est la suivante : protéines brutes 22% ; matière grasses brutes 10%; vitamines A/6000UI et E = 60mg; cuivre 20ppm; fer 145ppm ; manganèse 50ppm; Zink 120ppm; conservateur: E 202 et antioxydants: E310, E320. Elles sont abreuvées du coton imbibé d’eau. L’élevage est maintenu à une température de 25 à 28°C, une hygrométrie de 70 à 80% et une photopériode de 12 heures de lumière (Fig. 5).

Présentation de l’insecticide:

Indoxacarbe :

Indoxacarbe, nouvel insecticide a été découverte en Californie, en 2001, c’est une substance active (Steward) appartient à la famille des oxadiazines et possède une structure chimique originale. La formule moléculaire est C22H17ClF3N3O7 (Fig. 6). La formulation Commerciale (DuPont, Wilmington, USA) utilisée est à 30% WG de matière active (WG: granules dispersibles dans l’eau) (Tableau.1).
Figure 6. Structure chimique de l’indoxacarbe.

Etude toxicologique :

L’objectif de cette étude consiste à déterminer la dose sublétale (DL30) de l’indoxacarbe à l’égard des adultes nouvellement exuviés de B. germanica.
L’indoxacarbe, administré par ingestion sous forme d’un mélange (biscuit / insecticide) à des doses croissantes {0,125% ; 0,25% ; 0,5% ; 0,75% ; 1% et 2 % (poids /poids)}. L’essai pour chaque dose est conduit en utilisant 3 répétitions qui comportent chacune 13 adultes nouvellement exuvies, une série témoin est conduite en parallèle et les individus reçoivent uniquement le biscuit de chien.
Le pourcentage de mortalité corrigée des individus subissent une transformation angulaire selon Bliss (1938), cités par Fisher et Yates (1957). La détermination de la dose sublétale a été déterminée par un logiciel graph pad prisme 5. Les DL30, DL50 et DL90 avec leur limites de confiances 95s% (95% LC) et le Hillslope font l’objet d’une analyse de la variance à un seul critère de classification qui permet le classement des doses par le test HSD de tukey, afin d’évaluer l’effet de l’indoxacarbe.

Traitement des insectes et bio essai

L’indoxacarbe a été administre par ingestion à une dose sublétale DL30 (0,127%) sous forme d’un mélange (biscuit/ indoxacarbe) aux adultes de B. germanica nouvellement exuvie (0 jours). les témoins reçoivent uniquement biscuit. (Fig.7).

Dissection et Prélèvement des ovaires

Les femelles adultes des séries témoins et traités sont échantillonnées à différents âges (0, 1, 2, 3, 4, 5 et 6 jours) au cours de premier cycle gonadotrophique
Les adultes sont disséqués sous une loupe binoculaire (Zeiss), fixés ventralement sur une boite de paraffine, les pattes et les ailes sont sectionnées et le tégument de l’abdomen est incisé avec des micros ciseaux afin de récupérer les ovaires au cours de la maturité sexuelle après l’exuviation adulte (Fig. 8). Les ovaires prélevés ont été pesés à l’aide d’une balance de précision (Model GD-503-NTEP, Sartorius, Goettingen Germany). Puis déposés dans une solution tampon et conservés au froid (-20°C) jusqu’au dosage.

Morphométrie des ovaires

Après le prélèvement des ovaires des séries témoins et traitées, différents paramètres morphométriques ont été considérés comme, le nombre d’ovocytes par paire d’ovaire mais aussi la longueur (L), la largeur (l) et le volume de l’ovocyte basal. Les différentes mesures ont été déterminées à l’aide d’un micromètre oculaire préalablement étalonné.
Le volume (V) exprimé en mm3 est obtenu grâce à la formule de Lambreas et al. (1991):
Volume= 4π /3 (Longeur/2) (largeur/2)²

Analyses biochimiques chez les deux sexes :

Extraction et dosage des vitellines et vitellogénines

Les adultes femelles de B. germanica des séries témoins et traitées sont disséquée à différents âges (0, 1, 2, 3, 4, 5 et 6 jours) au cours de premier cycle gonadotrophique sous une loupe binoculaire. Le prélèvement biologique (ovaires et corps gras) préalablement pesé, est ensuite déposé dans un tampon (Tris- Hcl- Nacl) permettant l’extraction des vitellines et vitellogénines. La conservation se fait a -20C° jusqu’au dosage.

Technique d’extraction

L’extraction des vitellines et vitellogénines s’effectue selon la méthode de Descamps, 1996 in Fabre et al., 1990 (Fig. 9). Après homogénéisation et centrifugation on obtient 3 couches distincts, une couche surnageant qui représente les lipides, un culot contenant des glycoprotéines et une couche intermédiaire renfermant les vitellines et les vitellogénines. Les échantillons sont extraits dans une solution mère de tris-Hcl, qui consiste à diluer 3,02 g de tris (0,5 M) dans 300 ml d’eau distillée, puis ajuster cette solution à un pH de 7,4 avec de l’Hcl concentré et la compléter à 500 ml d’eau distillée.
Pour réaliser le tampon final: diluer 2,9 g de Nacl (0,5 M) dans 10 ml de la solution mère de Tris-Hcl compléter à 100 ml d’eau distillée.

Dosage des vitellines et vitellogénines

Le dosage des vitellines utilise le bleu brillant de coomassie (BBC) comme un réactif. La solution de BBC se prépare comme suit: dissoudre 50 mg de BBC dans 25 ml d’éthanol 95°. Après une agitation de 2 heures, on ajoute 50 ml d’acide orthophosphorique à 85% et on complète à 500 ml avec de l’eau distillée.
Le dosage est réalisé comme suit:
Prendre 100 µl de la couche intermédiaire obtenue après centrifugation, y additionner 4 ml de BBC, bien agiter puis passer à la lecture des densités optiques au spectrophotomètre à une longueur d’onde de 595 nm contre un blanc de gamme. Les résultats sont exprimés en µg/mg d’ovaire. La gamme d’étalonnage est réalisée à partir d’une solution d’albumine de sérum de bœuf (BSA) titrant 1 mg/ ml (Tableau. 2)
Tableau 2: Dosage de vitellines: réalisation de la gamme d’étalonnage.
La méthode consiste à additionné à une fraction aliquote de 100 µl de surnageant, 4 ml de réactif d’anthrone et après chauffage du mélange dans un bain marie (80°C pendant 10 min) une coloration verte se développe, dont l’intensité mesurée à une longueur d’onde de 620 nm est proportionnelle à la concentration des glucides présente dans l’échantillon.

Dosage des protéines

La quantification des protéines s’effectue selon la méthode de Bradford (1976) qui utilise le bleu brillant de coomassie G 250 (BBC) comme réactif et l’albumine de sérum de bœuf (B.S.A) comme standard (Merk). La gamme d’étalonnage (Tableau. 4) a été réalisée à partir d’une solution mère de B.S.A (1 mg/ml). Le bleu brillant de coomassie G 250 (conservation environ 21 jours à 4°C) se prépare comme suit :
 100 mg de BBC + 50 ml d’éthanol Agitation pendant deux heures
 100 ml d’acide orthophosphorique sont alors ajoutés et le tout est complété à 1000 ml avec de l’eau distillée.
Le dosage des protéines ovariennes a été effectué dans une fraction aliquote (100 μl). Les absorbances ont été obtenues grâce à un spectrophotomètre et la lecture a été réalisée à une longueur d’onde de 595 nm contre un blanc de gamme.

Dosage de lipides

La concentration de lipides totaux a été estimée selon Glodsworthy et al., 1972 utilisant le réactif sulfophosphov anillinique (0,38 g de vanilline, 55 ml d’eau distillée et 195 ml d’acide ortho phosphorique à 85 %). La solution mère des lipides est préparée en utilisant l’huile de table (Cevital) selon la procédure suivante: 25 mg d’huile de table pesés dans un tube eppendorf; cette quantité est ensuite reprise dans 10 ml du mélange (éther / chloroforme) (V/V) (Tableau. 5).

Table des matières

1. INTRODUCTION GENERALE
2. MATERIEL ET METHODE
2. 1. Taxonomie
2. 2. Présentation de l’insectes…
2. 2. 1. Cycle biologique de B. germanica
2. 3. Elevage des Blattes
2. 4. Présentation de l’insecticide
2. 4. 1. Indoxacarbe
2. 4. 1. 1. Etude toxicologique
2. 4. 1. 2. Traitement des insectes et bio essai
2. 5. Dissection et Prélèvement des ovaires
2. 6. Morphométrie des ovaires
2. 7. Analyses biochimiques
2. 7. 1. Extraction et dosage des vitellines et vitellogénines
2. 7. 1. 1. La technique d’extraction
2. 7. 1. 2. Dosage des vitellines et vitellogénines
2. 7. 2. Extraction des métabolites
2. 7. 2. 1. Dosage des glucides
2. 7. 2. 2. Dosage des protéines
2. 7. 2. 3. Dosage des lipides
2. 8. Etude histologiques des ovaires
2. 9. Analyse statistique
Chapitre 1 : Etude toxicologique de l’indoxacarbe
1. 1. Introduction
1. 2. Résultats
1. 2. 1. Toxicité de l’indoxacarbe à l’égard des adultes nouvellement exuviée de B. germanica et détermination des DL30, DL50 et DL90
1. 2. 1. 1. Après 10 jours de traitement
1. 3. Discussion
1. 3. 1. Etude toxicologique de l’indoxacarbe
1. 4. Conclusion
Chapitre 2 : Ingestion de l’indoxacarbe sur la reproduction
2. 1. Introduction
2. 2. Résultats
2. 2. 1. Effet de l’indoxacarbe sur la morphométrie des ovaires
2. 2. 1. 1. Effet sur le nombre d’ovocytes
2. 2.1. 2. Effet de l’indoxacarbe sur le poids frais (mg) de l’ovaire
2. 2. 1. 3. Effet de l’indoxacarbe sur la largeur (l) de l’ovocyte basal.
2. 2. 1. 4. Effet de l’indoxacarbe sur la longueur (L) de l’ovocyte basal
2. 2. 1. 5. Effet de l’indoxacarbe sur le volume de l’ovocyte basal (mm3)
2. 2. 2. Effet de l’indoxacarbe sur les vitellines et vitillogenines
2. 2. 2. 1. Effet de l’indoxacarbe sur les vitellines
2. 2. 2. 2. Effet de l’indoxacarbe sur les vitellogenines
2. 2. 3. Effet de l’indoxacarbe sur la biochimie chez les deux sexes
2. 2. 3. 1. Effet sur le contenu protéique ovarien et testiculaire
2. 2. 3. 1. 1. Effet sur le contenu protéique ovarien :
2. 2. 3. 1. 2. Effet sur le contenu en protéines testiculaires
2. 2. 3. 2. Effet sur le contenu en glucides ovarien et testiculaire
2. 2. 3. 2. 1. Effet sur le contenu en glucides chez les adultes femelles de B.germanica
2. 2. 3. 2. 2. Effet sur le contenu en glucides cez les adultes males de B.germanica nouvellement exuviee
2. 2. 3. 3. Effet sur le contenu en lipides chez les deux sexes
2. 2. 3. 3. 1. Effet sur le contenu en lipides ovarien
2. 2. 3. 3. 2. Effet sur le contenu en lipides testiculaires
2. 2. 4. Etude histologique
2. 2. 4. 1. Effet de l’indoxacarbe sur l’épaisseur de l’épithélium folliculaire (μm) des ovocytes
2. 3. DISCUSSION
2. 3. 1. Effet de l’indoxacarbe sur la morphométrie des ovaires
2. 3. 2. Effet de l’indoxacarbe sur les vitellines
2. 3. 3. .Effet de l’indoxacarbe sur les vitellogenines
2. 3. 4. Effet de l’indoxacarbe sur la biochimie chez les deux sexes
2. 3. 5. Etude histologique des ovaires sur la reproduction du B. germanica
2. 4. Conclusion
3. CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
4. RESUMES
Français
Anglais
Arabe
5. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
6. Annexes
7. Production scientifique