Identification génotypique (La PCR)

Identification génotypique La PCR

La PCR a été mise au point au milieu des années 80 par Kary MULLIS (Prix Nobel de Chimie 93). C’est une technique d’amplification génique qui est devenu un outil quasiment universel dans le domaine de la Biologie (5, 33, 39). Elle est basée sur l’amplification d’un segment d’ADN compris entre deux régions de séquences connues par un procédé d’extension d’amorces (25). A l’instar du séquençage de l’ADN, elle a révolutionné la génétique moléculaire en ouvrant une toute nouvelle voie dans l’étude et l’analyse des gènes. Un gène spécifique est une cible difficile à atteindre, parce que rare dans un génome complexe. C’était l’un des problèmes majeurs que la plupart des techniques utilisées en génétique moléculaire essayaient de surmonter. Ces techniques très coûteuses impliquaient des étapes de clonage, puis de détection de séquences d’ADN spécifique. La PCR a changé tout cela en permettant de produire des nombres gigantesques de copies de séquences d’ADN spécifique, sans pour autant passer par une étape de clonage (13, 25, 30).

..obtenues simplement en chauffant de l’ADN bicatenaire à des températures proches du point de fusion de la molécule. La Taq polymérase requiert aussi pour son fonctionnement une petite région d’ADN double brin pour initier la synthèse. Le point de départ peut donc être spécifié par l’hybridation d’un oligonucléotide complémentaire à une séquence déterminée de la matrice pour servir d’amorce (Primer) (24, 30), c’est la première caractéristique essentielle de la PCR. Les deux brins d’ADN peuvent servir de matrice pour la synthèse, sous réserve que l’on fournisse un oligonucléotide amorce pour chacun des brins. Dans cette technique, les deux oligonucléotiques amorces sont choisis de façon à encadrer la séquence d’ADN à amplifier de sorte que chaque brin nouvellement synthétisé s’étend au-delà de la position de l’amorce sur le brin opposé. Il se crée ainsi sur chacun des brins nouvellement synthétisés de nouveaux sites qui permettent la fixation des amorces. A la fin de chaque cycle, le nombre de brins d’ADN est multiplié par deux. Le résultat net de la PCR est qu’à la fin de n cycles, on dispose d’un maximum théorique de 2n molécules d’ADN double brin qui sont les copies de la séquence située entre les deux amorces. C’est la seconde caractéristique de la PCR ; le résultat est l’amplification d’une région spécifique. Dans la pratique, le rendement est beaucoup plus faible, et n’atteint jamais 100%. Toutefois l’expérience montre que si le rendement est inférieur à 70%, cas de séquences d’ADN difficiles à amplifier, les produits d’amplification sont détectables par simple coloration des gels d’électrophorèse lors de l’analyse du produit d’amplification. Pour surmonter ces écueils, un nombre de cycles de 30 à 40 est recommandé ; car un nombre de cycle trop élevé provoque l’accumulation des produits non spécifiques.

Extraction de l’ADN

 Les acides nucléiques sont extraits à partir d’échantillons biologiques variés : le sang la culture cellulaire, le crachat, tissus divers,…. Les méthodes utilisées pour libérer les acides nucléiques dépendent de : – la nature du spécimen et, en infectiologie, de celle du micro-organisme étudié. La lyse d’un mycoplasme est obtenue par simple ébullition et le lysat de qualité suffisante pour être directement amplifié par PCR. En revanche, la libération des acides nucléiques contenus dans une mycobactérie nécessite un traitement plus drastique, à savoir un traitement basé sur l’utilisation d’ultrasons ou bien associant soit sonde et chauffage, soit détergent (SDS) et protéinase K, à cause des parois des mycobactéries qui sont très résistantes. – la nature de l’ADN. On distingue deux familles particulières d’ADN. La première est celle de l’ADN génomique ou chromosomique d’organismes eucaryotes ou procaryotes. C’est celle qui est analysée en diagnostic clinique. La seconde famille rassemble les ADN recombinants d’origine plasmidique (ou phagique). A ces deux familles correspondent deux grandes méthodes d’extraction, qui présentent un certain nombre de points communs, les principes de base étant sensiblement les mêmes (30). Notre travail se limite à l’étude de l’ADN génomique ou chromosomique. 3-1-1- Extraction de l’ADN génomique ou chromosomique L’ADN peut être extrait par l’emploi de nombreux Kits d’extraction disponibles ou par l’emploi de méthodes standard Phénol/Chloroforme.