Principe de dosage de l’aflatoxine

EVALUATION DE L’IMPACT DE L’APPLICATION DES BONNES PRATIQUES DE TRANSFORMATION SUR LA TENEUR EN AFLATOXINE DANS LES PÂTES ET FARINES D’ARACHIDE DE FABRICATION ARTISANALE

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Méthodes :

Echantillonnage :

40 échantillons ont été prélevés au niveau de cinq régions dont 20 échantillons de pâte d’arachide et 20 échantillons de farine d’arachide. Les prélèvements ont été effectués au près des groupements ayant participé à des ateliers de formation sur les bonnes pratiques de transformation (Echantillon encadré « E ») d’une part et au niveau des marchés des mêmes localités (Echantillons non encadré« N ») d’autre part. Les échantillons ont été prélevés dans des flacons en plastiques soigneusement nettoyés. Tous les échantillons ont été acheminés au laboratoire à l’abri de la lumière et congelés immédiatement pour une bonne conservation.

Principe de dosage de l’aflatoxine

L’analyse des échantillons s’est effectuée suivant sur la norme française (NF EN 14 123) homologuée par le Directeur Général d’AFNOR le 26 Mars 2008 et qui à pris effet à partir du 26 Avril 2008 utilisant la méthode de dosage par HPLC avec dérivation post-colonne.
Une prise d’essai est extraite à l’aide du méthanol additionné à l’hexane. L’extrait d’échantillon est filtré et dilué avec un tampon phosphate (PBS : phosphate buffered saline) puis transféré dans une colonne d’immunoaffinité contenant des anticorps spécifiquement contre les aflatoxines B1, B2, G1 et G2. Les aflatoxines sont éluées de la colonne d’immunoaffinité grâce au méthanol. Elles sont ensuite quantifiées par HPLC (phase inverse) avec dérivation post-colonne par bromation suivi d’une détection fluorimétrique.

Extraction :

Prélever 25g de chaque échantillon auquel on ajoute 2.5g de sel (qui permet de casser les émulsions pour libérer les molécules d’aflatoxine emprisonnées). Ajouter 100ml de méthanol qui est le solvant d’extraction et 50ml d’hexane (qui permet la rétention de la matière grasse).
Mixer le mélange en utilisant l’homogénéisateur. Le produit obtenu est alors filtré.

Purification :

Elle consiste à ajouter 60ml de PBS ( Phosphate Buffered Saline) qui permet de renforcer l’affinité entre l’aflatoxine et le gel de la colonne d’immunoaffinité et protège ce dernier contre la détérioration par le méthanol à 10 ml du filtrat. Le mélange ainsi obtenu est versé à travers la colonne d’immunoaffinité à faible débit. Rincer la colonne avec 15ml d’eau distillée puis procéder au décrochage avec 2ml de méthanol. L’éluât obtenu est séché à sec sous l’azote.
Le résidu sec est ensuite repris avec 2ml d’acétone/eau (85v/15v) pour servir à l’injection (HPLC).

Quantification :

La chromatographie liquide haute performance (HPLC) à permis de déterminer la teneur en aflatoxine dans les échantillons collectés. Ces derniers doivent être totalement solubles dans la phase mobile qui sera appelé solvant d’élution (solvant ou mélange de solvants). Celui-ci doit être poussé à haute pression afin d’assurer un débit constant dans la colonne et y éviter toute perte de charges. Au niveau de la colonne, les composés en solution se répartissent suivant leur affinité, entre la phase mobile et la phase stationnaire. Ces interactions provoquent des échanges qui aboutissent à la séparation désirée. La théorie de la séparation montre que le signal enregistré à la sortie d’un détecteur approprié, en fin de colonne a la forme d’un pic. Si la séparation est bonne, chaque pic représente un constituant du mélange à séparer. L’ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme.
L’HPLC fait intervenir des mécanismes d’échange soluté / phase mobile / phase stationnaire, basés sur les coefficients de partage ou d’adsorption selon la nature des phases en présence.

Expression des résultats :

La teneur en aflatoxine exprimée en ug/kg ou ppb est donnée par la relation suivante:
Taf (µg/kg) = R x Vr / Pe
Taf : teneur en aflatoxine ;
R : résultat en ng/mg de la reprise suite à l’injection affiché après intégration (HPLC) ;
Vr : volume de reprise ( quantité de solvant eau/acétone utilisée pour la reprise du résidu sec = 2ml) ;
Pe : poids de l’échantillon contenu dans 10ml de filtrat purifié.
La norme utilisée pour l’appréciation de la qualité des échantillons est la norme sénégalaise (NS 03-053 ; Avril 2001), éditée et diffusée par l’Association Sénégalaise de Normalisation (ASN) qui définit les caractéristiques de qualité que doit présenter la pâte d’arachide destinée à la consommation humaine. Elle fixe la teneur en AFB1 à 15ppb et en aflatoxines totales à 25ppb. Il n’y a pas encore de spécifications normatives en ce qui concerne la farine d’arachide.

Présentation des résultats

Exploitation des chromatogrammes

Les résultats de l’analyse de chaque échantillon se présentent sous forme d’un chromatogramme qui montre successivement un signal d’injection suivi de quatre pics d’aflatoxine avec des temps de rétention dans l’ordre AFG2, AFG1, AFB2 et AFB1 comme nous le montre la figure n°2 ci-dessous :
Figure N°2 : Chromatogramme d’un échantillon x
Les aires et tailles des pics ont permis de déterminer la concentration en aflatoxine des échantillons analysés en ng/ml puis celle en µg/kg de l’échantillon.

Niveau de contamination en aflatoxine des échantillons :

Niveau de contamination en aflatoxine des pâtes :

Les résultats des échantillons de pâte d’arachide collectés dans cinq régions du Sénégal sont résumés dans le tableau III ci-après : Tableau III : Teneur en aflatoxine des échantillons de pâte d’arachide
N : échantillon du marché ; E : échantillon après encadrement ; ND : non détecté Ces résultats montrent que l’AFB1 est présente dans tous les échantillons prélevés tandis-que l’AFG2 est inexistante dans les échantillons des régions de Bouchoura et Ndiongnick. On constate également que les échantillons prélevés au niveau des marchés sont nettement plus contaminés.

Teneur en aflatoxine des échantillons de farine d’arachide :

Les résultats des échantillons de farine d’arachide collectés dans cinq régions du Sénégal sont résumés dans le tableau IV ci-après : Tableau IV : Teneur en aflatoxine des échantillons de farine d’arachide « Noflaye »
N : échantillon du marché ; E : échantillon après encadrement ; ND : non détecté Ces résultats montrent que l’AFB1 est présente dans tous les échantillons prélevés tandis-que l’AFG2 est inexistante dans les échantillons des régions de Koumpentoum, K soce, Wack Ngouneu, Diossong et Niakhar.

Répartition de la teneur moyenne en aflatoxine dans les échantillons :

La répartition de la teneur moyenne en aflatoxine B1 et en aflatoxine totale a été déterminée sur les échantillons de pâte et de farine fabriqués par les unités dont le personnel a été formé aux bonnes pratiques et sur ceux prélevés au niveau du marché comme l’indique la figure N° 3 ci-après : Figure N° 3: Teneur moyenne en aflatoxine des échantillons
On remarque que les échantillons de la farine d’arachide du marché renferment une concentration en AFB1 et en aflatoxine totale supérieure à celle des pâtes du marché tandis-que les échantillons provenant des unités encadrés renferment des teneurs nettement moins élevées.

Fréquence de détection des différents types d’aflatoxines des échantillons :

Elle permet de mettre en évidence le type d’aflatoxine le plus rencontré.
Figure N°4: Fréquence de détection des différents types d’aflatoxines dans les échantillons
On remarque que l’AFB1est majoritaire avec une fréquence très élevée (81%) dans les échantillons. Viennent ensuite l’AFG1, AFB2 et AFG2 (minoritaires).

DISCUSSION

Du point de vue règlementaire, certaines difficultés liées au caractère « incomplet » de la norme sénégalaise par rapport aux aflatoxines dans les denrées alimentaires tendent à limiter l’analyse et la discussion des résultats issus de cette étude.
En effet, la norme sénégalaise n’existe que pour la pâte. Elle fixe la teneur en aflatoxine B1 à 15ppb et en aflatoxines totales à 25ppb dans les pâtes d’arachide pour la consommation humaine. Il n’existe pas encore de seuil limite par rapport à la farine d’arachide. Néanmoins, vu que la farine est produite à partir de l’arachide et est également destinée à la consommation humaine, nous allons faire référence à la norme sur la pâte dans notre discussion.
Les résultats obtenus permettent de dire que l’AFB1 est fortement présente dans tous les échantillons et contribue presque à elle seule à la teneur en aflatoxine totale car celle des AFG1 est négligeable et celle des AFB2 et AFG2 est très minoritaire. Cela nous amènera à plus focaliser notre discussion sur l’AFB1.
Considérant le lot des pâtes d’arachide du marché, la teneur minimale en AFB1 est de 1,6ppb et est obtenue dans la région de Niakhar tandis-que celle maximale est de 80,4ppb obtenue à Réfane.
En ce qui concerne le lot des farines d’arachide du marché, la teneur minimale en AFB1 est de 17,5ppb obtenue dans la région de Bouchoura tandis-que celle maximale est de 122,1ppb à Réfane.
Pour cette localité, on peut soupçonner une très forte contamination de la matière première et la quasi inexistence des méthodes de décontamination dans le processus de transformation.
Il ressort au vu des résultats, une forte variabilité des teneurs en aflatoxine dans les pâtes et farines d’arachide d’une région à une autre. Cela expliquerait les différences des facteurs climatiques parfois peu perceptibles mais suffisantes pour influencer la contamination des produits alimentaires aussi bien au champ que pendant le stockage. Au nombre de ces facteurs, nous pouvons principalement citer la température et l’humidité.
Par ailleurs, les producteurs et les transformateurs d’arachide n’ayant pas le même niveau de perception par rapport au danger que constitue la présence de cette toxine dans les denrées ainsi que les moyens préventifs et de décontamination, adoptent des comportements variés. La plupart du temps, ils n’appliquent pas les bonnes pratiques. Les conséquences se traduisent par les fortes concentrations en aflatoxine observées dans les échantillons. Il arrive exceptionnellement que l’on trouve sur le marché un échantillon de bonne qualité sanitaire comme c’est le cas à Niakhar où l’échantillon de la pâte d’arachide du marché est conforme à la norme de l’Union européenne avec une teneur en AFB1 de 1,6ppb et 2,5ppb pour celle en aflatoxine totale.
Il serait également possible que certaines souches d’Aspergillus produisant prioritairement de l’AFB1 au détriment du reste (AFB2, AFG1 et AFG2) soient plus présentes dans une région par rapport à une autre.
En fin, il y a l’avidité de certains transformateurs qui ne prennent pas la précaution de procéder au triage avant d’engager le processus de transformation guidés seulement par la quête d’un rendement élevé.
Notons que la forte concentration en aflatoxine, particulièrement celle en AFB1 corrobore celle menée par Kane et al, 1991 portant sur 22 échantillons de pâtes. D’après cette étude, 55% des échantillons s’étaient révélés positifs pour une teneur moyenne de 62ppb avec 5ppb et 750ppb comme limites extrêmes. Cette moyenne est supérieure à la notre (45,88ppb) en dépit de la différence du nombre des échantillons et traduit une prise de conscience de plus en plus croissante de la population face à ce danger. Cependant, tous nos échantillons sont contaminés.
D’autres études à l’instar de celle menée par Ndong, 2012 portant sur 44 échantillons de pâte, avaient révélé la moyenne en AFB1 de 25.66ppb. Cette valeur qui est inférieure à celle trouvée par Mbenghat, 2012 (41.26ppb) et la notre (36.87ppb) peut s’expliquer par le fait que l’échantillonnage s’est déroulé dans des régions différentes et durant différentes périodes. En effet, le risque de contamination des produits varierait selon que les prélèvements aient lieu dans une période proche ou lointaine des récoltes. Ce qui pose le problème de gestion de stock (Delobel et al, 1996). Cette même étude (Ndong, 2012) aboutit à une moyenne de 68.08ppb pour l’AFB1 dans les échantillons de farine d’arachide. Une valeur qui semble être proche de la notre (58.67ppb).
Par contre, celle menée par Sall, 1998 semble contredire nos résultats par rapport à la fréquence de détection des types d’aflatoxines dans les échantillons de pâte d’arachide du marché. En effet, selon cette étude, l’aflatoxine G1est présente dans 95% des échantillons et est majoritaire, suivie des aflatoxines B1 (70%). Ce qui n’est pas le cas dans notre étude où l’AFB1 (majoritaire) et l’AFG1sont présentes dans tous les échantillons. Une émergence de la colonisation des différentes souches d’Aspergillus avec une dominance de celles sécrétant l’AFB1 (Apergillus flavus) dans le temps serait une hypothèse pour l’explication de cette contradiction.
La forte concentration moyenne (58,67ppb) en aflatoxine des lots de farine par rapport à celle des pâtes (36,87ppb) révélée par notre étude au niveau des échantillons du marché et qui confirment les travaux de Ndong, 2012 avec des valeurs respectives de 68,08ppb et 25,66ppb sont en accord avec les travaux de Lee, 1965 qui rapporte une perte pouvant aller à 50% des aflatoxines lors de la torréfaction de l’arachide pour la fabrication du beurre (pâte).
Après sensibilisation, les résultats issus des analyses des échantillons montrent une baisse considérable des teneurs en aflatoxine. Elle s’illustre par les résultats obtenus par rapport aux lots après sensibilisation. Par exemple, les teneurs moyennes de 36,84ppb pour les pâtes du marché chutent à 5,75ppb, soit une baisse de 84,40% en ce qui concerne l’AFB1 et passent de 45,88ppb à 8,22ppb pour l’aflatoxine totale, soit une réduction de 82,08%.
Les teneurs moyennes de 58,67ppb pour les échantillons de farine chutent à 9,96ppb en ce qui concerne l’AFB1, soit une réduction de 83,02% et passent de 68,90ppb à 14,36ppb, soit une réduction de 79,15% en ce qui concerne la teneur en aflatoxine totale.
Les taux de réduction de l’aflatoxine observés après sensibilisation, ont sensiblement augmenté le taux de conformité des échantillons par rapport à la norme sénégalaise. En effet, 85% des échantillons du marché est non conforme par rapport à la dite norme. Ce taux passe à 25% des échantillons après sensibilisation. Notons que ce taux pourrait subir une baisse considérable si la matière première pouvait être moins contaminée et si les bonnes pratiques de stockage et de transformation deviennent un reflexe dans le comportement des transformateurs et sont convenablement appliquées.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre 1: ARACHIDE ET AFLATOXINES
I- ARACHIDE
1- Définition
2- Critères de qualité
3- Usages locaux
3-1- Quelques plats populaires à base de pâte d’arachide
II- AFLATOXINES
1- Définition, origine et production
2- Propriétés physico-chimiques
3- Toxicité
4- Toxicocinétique
5- Risques pour l’homme
6- Moyens de lutte
6-1- Moyens préventifs
6-2- Moyens curatifs
6-2-1- Méthodes physiques d’élimination et de détoxification
6-2-2- Méthode de décontamination par adsorption des mycotoxines en solution
6-2-3- Méthodes chimiques de décontamination
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
Chapitre I : MATERIEL ET METHODES
I- Cadre de l’étude
II- Matériel
II-1- Echantillons
II-2- Matériel de laboratoire
II-2-1- Appareils et verrerie de laboratoire
II-2-2- Réactifs de laboratoire
III- Méthodes
III-1- Echantillonnage
III-2- Principe de dosage de l’aflatoxine
III-2-1- Extraction
III-2-2- Purification
III-2-3- Quantification
III-3- Expression des résultats
Chapitre 2 : RESULTATS
I- Présentation des résultats
I-1- Exploitation des chromatogrammes
I-2- Niveau de contamination en aflatoxine des échantillons
I-2-1- Niveau de contamination en aflatoxine des pâtes
I-2-2- Teneur en aflatoxine des échantillons de farine d’arachide
I-2-3 Répartition de la teneur moyenne en aflatoxine des échantillons
I-2-4 Fréquence de détection des différents types d’aflatoxines dans les échantillons
Chapitre 3 : DISCUSSION
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE

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