LA LUTTE CONTRE LE VIRUS DU ROSS RIVER

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La lutte contre le virus Ross River

Les stratégies d’intervention face aux arboviroses correspondent principalement à la prévention avant l’installation d’une épidémie et à son contrôle une fois établie, selon son ampleur et sa propagation. Classiquement, l’Organisation Mondiale de la Santé définit quatre niveaux de prévention :
– la prévention primaire qui vise à empêcher l’apparition de nouveaux cas dans une population saine et qui est donc applicable à l’ensemble de la population ;
– la prévention secondaire qui consiste en tous les actes destinés à diminuer la prévalence d’une maladie et est applicable à un individu à haut risque ;
– la prévention tertiaire qui se rapporte à tous les actes destinés à diminuer la prévalence des cas chroniques et la rechute d’un patient pour lequel la maladie a déjà été présente ;
– la prévention quaternaire correspondant aux soins palliatifs.
La prévention primaire reste à ce jour la stratégie la plus efficace contre les arboviroses. Elle comprend, entre autre, la lutte vectorielle ainsi que la protection individuelle. La lutte anti-vectorielle consiste à réduire ou éliminer la densité de la population de moustiques et ainsi réduire le risque d’infection. La protection personnelle consiste à limiter les surfaces d’exposition et/ou les contacts hôte-vecteur par des répulsifs, afin de réduire l’incidence des infections.
La vaccination est davantage ciblée sur l’hôte que le vecteur et fait partie des mesures collectives qui peuvent être prises en prévention primaire. Elle aura pour effet de stimuler les défenses du système immunitaire de l’hôte afin d’empêcher la propagation du virus.
Les antiviraux constituent une autre stratégie d’intervention, par leur effet délétère sur les étapes nécessaires à l’entrée et/ou la réplication du virus dans les cellules. La multiplication virale étant inhibée, le virus se dissémine moins dans l’organisme et cela réduit aussi les risques de contamination à d’autres individus.

Les répulsifs

Les répulsifs cutanés

Les répulsifs sont utilisés depuis longtemps pour la prévention des maladies vectorielles. Ils ont pour but d’empêcher la piqûre des vecteurs hématophages sur les hôtes. Ils ne sont pas spécifiques aux arboviroses mais ont une efficacité variable selon le vecteur.
Il existe différents types de répulsifs :
– les répulsifs physiques, essentiellement les ultrasons ;
– les répulsifs oraux, qui sont principalement des vitamines du groupe B (vitamine B ou thiamine) ;
– les répulsifs de contact et odorants, qui peuvent être d’origine synthétique ou naturelle.
L’efficacité des répulsifs physiques et oraux a été remise en cause (Ives and Paskewitz, 2005 ; Croft, 2010) et les répulsifs de contact et odorants restent les mieux tolérés à ce jour. Les répulsifs sont de compositions chimiques plus ou moins complexes (molécules simples ou mélanges) qui altèrent le comportement du vecteur en le détournant de sa cible. Certains empêchent la piqûre de manière mécanique comme la formulation Avon Skin-So-Soft®, qui utilise un film huileux piégeant les moustiques (Magnon et al., 1991).
Les molécules répulsives ainsi que leurs différentes formulations sont désormais soumises à une règlementation européenne stricte pour leur mise à disposition sur le marché. Cette règlementation intègre des aspects sanitaires et environnementaux (Journal officiel de l’Union européenne, 2012, sec. L 167/1). Elle concerne aussi bien les répulsifs d’origine synthétique que ceux d’origine naturelle.

Les répulsifs synthétiques

L’utilisation de répulsifs contre les insectes remonte à l’Antiquité, avec l’utilisation de feux, fumées ou encore par application de boue et l’usage de certaines plantes. Ce n’est qu’au début du XXème siècle que des répulsifs à base de molécules synthétiques ont été développés avec le diméthyle phtalate en 1929, puis Indalone® en 1937 (Brown and Hebert, 1997) et Rutgers 612 en 1939 (Peterson and Coats, 2001).
La recherche d’une protection efficace pour les soldats américains lors de la Seconde Guerre mondiale a permis d’identifier le DEET (N,N-diéthyl-m-toluamide) (Figure 7). Il est depuis, un des composés répulsif le plus efficace et le plus utilisé dans les formulations (Brown and Hebert, 1997 ; Patel et al., 2016). Il possède un large spectre d’action envers les insectes nuisibles comme les moustiques, les tiques, les moucherons. Son application permet une protection de plusieurs heures contre les moustiques avec des formulations allant jusqu’à 50 % en substance active (Moore et al., 2007a). Les répulsifs à base de DEET disposant d’une autorisation de mise sur le marché (AMM) ne sont toutefois pas utilisables en France pour les enfants âgés de moins de 2 ans (Ministère des affaires sociales et de la santé, 2016) (Caumes and Camus, 2015). Cependant le DEET n’est pas une molécule neutre mais possède des fonctions amide. C’est donc un puissant solvant inflammable (Katz et al., 2008). Il a également pour inconvénients de dissoudre le plastique et de détériorer certains autres composés mais il reste sans risque pour le coton, la laine et le nylon. Il aurait aussi un potentiel immuno-modulateur sur la souris à des doses comparables à celles que l’on peut retrouver chez l’Homme (Keil et al., 2009).
Depuis, d’autres molécules répulsives ont été proposées dont l’icaridine connue aussi sous la dénomination picaridine ou KBR3023 (Carboxylate de Sec-butyl 2-(2-hydroxyéthyl) pipéridine-1), qui est couramment utilisée dans les formulations disponibles en Europe et indiquées en France par le ministère des affaires sociales et de la santé (Ministère des affaires sociales et de la santé, 2016) (Figure 7). Les concentrations utilisées vont jusqu’à 20 % en substance active (Katz et al., 2008 ; Caumes and Camus, 2015). Cette molécule a pour avantage d’être sans odeur et non corrosive pour le plastique tout en ayant une efficacité comparable à celle du DEET (Debboun et al., 2006 ; Katz et al., 2008).
Les autres substances actives utilisées dans les répulsifs recommandés par l’agence nationale de santé publique sont IR3535 (N-acétyl-N-butyl-β-alaninate d’éthyle) et PMDRBO (mélange de cis- et trans-p-menthane-3,8-diol) (Figure 7). Ces deux substances sont répertoriées comme ingrédients actifs de biopesticides par l’USEPA (United States Environmental Protection Agency). Ce sont des équivalents synthétiques ou des produits dérivés de substances naturelles. IR3535 possède une structure similaire à la β-alanine et est utilisée à des concentrations comprises entre 20 et 30 % (Debboun et al., 2006). PMDRBO est trouvé entre 19 et 25 % en formulation et il peut être obtenu soit par hydrodistillation des feuilles d’Eucalyptus citriodora ou par modification chimique du citronellal (Dell, 2009).

Les répulsifs naturels

De nombreuses huiles essentielles sont utilisées de manière traditionnelle comme répulsifs naturels contre les arthropodes (Pavela and Benelli, 2016). Certaines plantes sont utilisées telles quelles, mais les huiles essentielles restent la formulation la plus couramment exploitée. L’huile essentielle de la citronnelle est l’un des premiers répulsifs naturels connus avec celles de l’eucalyptus, de laurier, de l’anis et de la bergamote (Debboun et al., 2006). Plusieurs espèces végétales ont été reconnues pour leurs propriétés répulsives contre les insectes, en particulier contre les moustiques (Tableau 1). Les espèces Cymbopogon, Eucalyptus et Ocimum sont les plus étudiées pour leur activité répulsive (Nerio et al., 2010).
En tant que produits naturels, ces répulsifs sont en général mieux acceptés par la population que les répulsifs synthétiques. Toutefois, en tant que biocides, ils sont soumis à la même réglementation que les répulsifs synthétiques comme indiqué précédemment (II.1.1 -) et doivent être aussi évalués, tant au niveau des risques sanitaires et écologiques que de leur efficacité de protection. L’activité répulsive est évaluée selon la procédure standard définie par l’OMS pour les répulsifs spatiaux en conditions de laboratoire (World Health Organization, 2013) ou les procédures de l’ASTM (American Society for Testing and Materials) ou de l’USEPA (U.S. Environmental Protection Agency) (Barnard, 2005).
Comme indiqué précédemment, l’évaluation des répulsifs doit désormais intégrer leurs risques sanitaires en raison de leurs possibles effets indésirables comme pour les médicaments (Foster et al., 2005). En effet, certaines huiles essentielles sont responsables de dermatites ou d’allergies, comme l’huile essentielle de l’arbre à thé (Trumble, 2002) ou encore l’huile essentielle de romarin (Trattner et al., 2008).
Les huiles essentielles sont constituées par un mélange complexe des composés aromatiques volatils (COV) obtenu généralement par hydrodistillation ou entrainement à la vapeur. La composition de ces huiles comprend majoritairement des monoterpènes, des sesquiterpènes et des composés 36 oxygénés comme les alcools, les aldéhydes et les esters. Les terpènes ont été identifiés comme composés responsables de l’activité répulsive (Omolo et al., 2004 ; Nerio et al., 2010). La plupart de ces composés répulsifs sont des terpènes oxygénés avec un groupement hydroxyle lié à un carbone primaire, secondaire ou aromatique (Nerio et al., 2010). Toutefois, une étude au Kenya mesurant l’activité répulsive des huiles essentielles Croton pseudopulchellus, Mkilua fragrans, Endostemon tereticaulis, Ocimum forskolei, Ocimum fischeri et Plectranthus longipes et leurs composés majoritaires d’autre part, montre que l’activité répulsive individuelle des composés est en deçà de l’activité répulsive de l’huile essentielle totale (Odalo et al., 2005). L’activité répulsive de ces huiles essentielles serait la résultante d’un effet synergique des composés.
De nombreuses formulations contenant des huiles essentielles ou des constituants de ces huiles sont brevetées chaque année comme répulsifs (Pohlit et al., 2011). Ces formulations cherchent à améliorer l’efficacité des répulsifs à base d’huiles essentielles.

Mécanismes d’action

Lors du repas sanguin de la femelle moustique, la première barrière rencontrée est la peau qui est l’interface entre l’environnement extérieur et l’organisme. La peau est constituée d’une couche supérieure, l’épiderme, puis du derme et de l’hypoderme (Figure 8). L’épiderme est un épithélium stratifié non vascularisé composé principalement de kératinocytes et de mélanocytes. Suivant la morphologie des kératinocytes, on distingue plusieurs couches dans l’épiderme (couche germinative, épineuse, granuleuse, stratum lucidum et stratum corneum) (Tobin, 2006).
Le derme est un tissu conjonctif vascularisé comprenant des fibroblastes et des cellules du système immunitaire. En tant que tissu conjonctif, il contient plusieurs protéines et une matrice extracellulaire constituée principalement de fibres de collagène mais aussi d’élastine et de fibrillines. Enfin, l’hypoderme est la couche la plus interne. C’est aussi un tissu conjonctif richement vascularisé composé principalement d’adipocytes.
La femelle moustique, lors de la recherche d’un hôte pour se nourrir est sensible à divers stimuli (visuels, thermiques et olfactifs) émis par celui-ci. Des différences d’attractivité ont lieu selon les espèces de moustiques et selon leurs hôtes (Mukabana et al., 2002 ; Lindsay et al., 2000). Les stimuli sont détectés par les sensilles des moustiques. Les sensilles sont composées de plusieurs neurones et sont concentrées principalement sur les antennes (McIver, 1974).
Au niveau olfactif, c’est un ensemble de composés (acide lactique, dioxyde de carbone, ammoniac, acides carboxyliques, oct-1-én-3-ol et autres composés de la sueur) qui stimule les sensilles du moustique et non pas un seul composé (Keswani and Bellare, 2006 ; McBride, 2016). Ainsi en étudiant le comportement et la réponse à l’électro-antennogramme de moustiques, une plus grande attractivité de ces derniers pour la sueur humaine incubée pendant deux jours que pour la sueur humaine fraîche a été observée (Meijerink et al., 2000). Cette différence d’attractivité serait due à une différence de pH et/ou de composition (Braks and Takken, 1999).
Ces capacités olfactives des moustiques sont utilisées dans la lutte vectorielle. Des odeurs attractives peuvent être utilisées comme leurre, par exemple le dioxyde de carbone ou l’odeur du fromage Limburger (Ray, 2015 ; Knols, 1996). Plus généralement, des répulsifs de contact odorants sont appliqués sur la peau. L’activité répulsive serait le résultat d’événements physiques et biochimiques. Ces répulsifs formeraient une barrière de vapeur, empêchant la détection des molécules attractives de l’hôte. Les mécanismes moléculaires du fonctionnement des répulsifs sont peu connus, mais certaines molécules agiraient sur les récepteurs olfactifs des moustiques (Bohbot et al., 2011 ; Dickens and Bohbot, 2013 ; Peterson and Coats, 2001 ; Amer and Mehlhorn, 2006b). Le DEET pourrait agir à distance ou par contact direct. Son action porterait sur le récepteur des composés attractifs. Le DEET entrerait alors en compétition avec la molécule oct-1-én-3-ol, attractive pour le moustique ; le récepteur neuronal olfactif Orco serait impliqué dans ce mécanisme (Leal, 2014 ; Ditzen et al., 2008).
L’étude du mécanisme d’action des répulsifs naturels est peu développée, du fait de la composition complexe de l’huile essentielle et du potentiel effet synergique de ses constituants.

Avantages et limites des répulsifs synthétiques et naturels

Les répulsifs synthétiques de compositions chimiques parfaitement maitrisées ont été sélectionnés pour leur large spectre d’action et ont été formulés (après 40 ans d’utilisation) pour garantir leur stabilité et une grande efficacité du fait de leur persistance sur la peau. La durée de protection du DEET face aux moustiques de l’espèce Aedes peut aller jusqu’à dix heures (Lupi et al., 2013). Toutefois, des effets secondaires liés à l’utilisation de cette substance ont été reportés : réactions allergiques mais aussi des effets neurotoxiques et des problèmes cardiovasculaires (Brown and Hebert, 1997 ; Zadikoff 1979 ; Corbel et al., 2009).
De plus, s’agissant d’une molécule unique ciblant les récepteurs olfactifs, les moustiques sont capables de devenir résistant au DEET : Aedes aegypti, préalablement exposé au DEET, peut devenir insensible au DEET du fait d’une anergisation probable des neurones des récepteurs olfactifs en présence du DEET (Stanczyk et al., 2013). Par ailleurs, Aedes aegypti préalablement exposé au virus Sindbis peut perdre sa sensibilité au DEET, ou au composé picaridine (Qualls et al., 2011 ; Qualls et al., 2012).
Dans ce contexte, on constate une utilisation accrue des huiles essentielles comme répulsifs anti-moustiques. Ces répulsifs naturels, mélanges complexes, ont généralement un large spectre d’action et il est plus difficile pour les moustiques de développer une résistance. Le fait que ce soient des ressources renouvelables et disponibles directement dans les zones tropicales, là où peuvent avoir lieu les épidémies est un avantage supplémentaire. Cependant leur durée de protection reste inférieure à celle des répulsifs synthétiques comme le DEET (Nerio et al., 2010 ; Maia and Moore, 2011). Afin d’augmenter leur efficacité, de nouvelles formulations ont été développées, telles que la production de répulsifs combinés, l’ajout d’additifs pour stabiliser les produits avec l’utilisation de la paraffine, de la vanilline ou de l’acide salicylurique (Nerio et al., 2010). L’objectif est de réduire la volatilité des huiles et de trouver un compromis entre des concentrations efficaces pour l’effet répulsif et les effets secondaires comme les allergies (Semmler et al., 2014).

Vaccins

Les vaccins entrent dans le cadre d’une stratégie de prévention ciblée. En effet, ce sont des outils spécifiques d’un virus, contrairement aux répulsifs qui visent les vecteurs sans sélectivité. Le principe du vaccin se base sur la capacité du système immunitaire à se défendre contre des agents pathogènes. Le vaccin repose sur un agent extérieur qui est introduit pour provoquer une réponse immunitaire de l’organisme. Cet agent extérieur peut être un virus vivant atténué, un agent infectieux inactivé, des fragments d’un agent pathogène ou encore des toxines bactériennes inactives. L’immunité de l’organisme est alors acquise, sans développer de pathogénicité par l’induction d’une mémoire immunitaire. Lorsque l’organisme sera en contact avec le véritable agent pathogène, la réaction immunitaire mémoire développera alors une réponse efficace beaucoup plus rapidement (Campbell and Reece, 2007).
Un vaccin basé sur l’inactivation du virus Ross River a été développée par Aaskov et al. Le virus, isolé à partir d’un patient a d’abord été incubé avec du BEI (éthylèneimine binaire), puis concentré par 39 centrifugation. Le BEI est utilisé pour diminuer la capacité infectieuse du virus, tout en conservant l’immunogénicité du virion. En effet, il agirait sur les acides nucléiques mais les épitopes des protéines du virus conserveraient leur conformation et leur accessibilité pour leur reconnaissance par les anticorps (Blackburn and Besselaar, 1991 ; Bahnemann, 1990). Des injections intramusculaires et intraveineuses de cette préparation brute ont été menées sur des souris BALB/c. Le sérum de ces souris immunisées montrait alors une production d’immunoglobulines IgM et IgG dirigées contre le virus Ross River et qui était comparable à celle de souris ayant été infectées par le virus (Yu and Aaskov, 1994). Quelques années plus tard, cette même équipe a repris cette procédure en ajoutant cette fois-ci une étape de purification du virus inactivé. Après avoir reçu ce vaccin, des souris infectées in vivo par le virus Ross River ne développèrent pas de symptômes liés à l’infection. Le sérum produit montrait alors une production d’anticorps dirigés contre le virus in vitro (Aaskov et al., 1997).
L’utilisation du BEI pour inactiver le virus n’étant pas applicable à l’échelle industrielle, du fait des étapes laborieuses de purification, un vaccin a été développé en inactivant le virus Ross River avec le formaldéhyde et des radiations ultraviolettes (Kistner et al., 2007). Une forme couplée ou non à un adjuvant hydroxyde d’aluminium a été également testée sur des souris et des cochons d’inde par immunisation subcutanée. Les anticorps neutralisants le virus Ross River ont été alors quantifiés dans les sérums in vitro et la virémie suivie sur les animaux confrontés au virus. Selon plusieurs études, ce vaccin serait efficace sur le modèle animal (Holzer et al., 2011). Depuis, il a été testé avec succès sur 382 adultes européens n’ayant jamais été infectés par le virus Ross River (Aichinger et al., 2011). Plus récemment, une étude sur 1 755 adultes australiens a montré une vaccination contre le virus Ross river plus efficace en terme de production d’anticorps chez les jeunes adultes (16-59 ans) que chez les personnes de plus de 60 ans (Wressnigg et al., 2015). Toutefois, malgré les travaux de cette équipe, il n’existe toujours pas de vaccins commercialisés pour l’infection contre le virus Ross River.

Les antiviraux

En l’absence de vaccins, les antiviraux restent une mesure efficace contre l’infection virale. Ils agissent sur le cycle de vie du virus. Contrairement aux répulsifs et aux vaccins, les antiviraux interviennent sur l’organisme déjà infecté après apparition des symptômes. Ils peuvent soit empêcher l’entrée du virus dans la cellule-hôte, soit agir au niveau de la réplication de son matériel génétique ou encore lors de l’étape d’assemblage de ses éléments constitutifs (Figure 6 et Tableau 2).
Une des difficultés majeures dans le développement d’antiviraux est de caractériser une action spécifique sur les enzymes virales sans perturber le fonctionnement cellulaire de l’organisme-hôte. Cette action peut être dirigée spécifiquement contre une protéine du virus, comme par exemple pour un composé de type benzimidazole qui semble avoir une activité antivirale contre l’alphavirus du Chikungunya en agissant spécifiquement au niveau de la protéine nsP4, impliquée dans la réplication du virus (Wada et al., 2017). La stratégie antivirale peut être limitée par la mutation et/ou résistance que peut développer le virus qui n’a pas été éradiqué. Mais le développement plus rapide des antiviraux par rapport aux vaccins permet d’intervenir plus rapidement contre les infections.
L’ensemble des molécules antivirales connues pour agir sur les alphavirus tel que le virus du Chikungunya a été répertorié récemment (Abdelnabi et al., 2015 ; Ahola et al., 2015). On peut classer ces molécules antivirales suivant leur mode d’action. Certaines, comme la chloroquine ou l’obatoclax, agissent sur l’attachement du virus en inhibant l’acidification de l’endosome avant la fusion du virus (Khan et al., 2010 ; Chopra et al., 2014 ; Varghese et al., 2017). Le médicament Arbidol et les flavaglines (composés naturels) empêchent, eux aussi, l’attachement de l’alphavirus sur les cellules hôtes (Chopra et al., 2014 ; Delogu et al., 2011 ; Wintachai et al., 2015).
Les antiviraux peuvent également agir sur la synthèse protéique, comme les petits ARNs interférents (siRNAs) qui ciblent les protéines nsP1 et E2, ou encore l’harringtonine et l’homoharringtonine qui inhiberaient la production des protéines nsP3 et E2 (Parashar et al., 2013 ; Kaur and Chu, 2013). D’autres molécules comme la ribavirine (analogue nucléosidique) ou la favipiravir (dérivé de la pyrazinamide) ou des dérivés de la structure thiazolidine inhibent la réplication virale (Briolant et al., 2004 ; Rothan et al., 2014 ; Delang et al., 2014 ; Jadav et al., 2015). Les composés naturels 5,7-dihydroxyflavones ont été également décrits comme inhibiteurs du virus du Chikungunya mais leur mécanisme d’action n’a pas encore été résolu (Pohjala et al., 2011).
La recherche de nouveaux antiviraux est désormais appuyée par la bio-informatique qui permet d’identifier de potentiels candidats, inhibiteurs des enzymes virales (Bassetto et al., 2013 ; Byler et al., 2016). Cependant, ils restent encore peu applicables in vivo. Par exemple, le traitement par la chloroquine s’est révélé inefficace dans une étude menée à La Réunion sur des patients infectés par le virus du Chikungunya (Lamballerie et al., 2008). Depuis ces dernières années, de nombreuses études ont été menées pour identifier des antiviraux spécifiques ou non des alphavirus (Tableau 2). Plusieurs de ces composés sont d’origine naturelle en tant que métabolites secondaires de plantes ou de bactéries. Ainsi de nombreux flavonoïdes, tels que la baicaléine, le kaempférol, la naringinine, la quercétine, la quercétagétine ou la sylimarine ont une activité antivirale contre le virus du Chikungunya (Lani et al., 2015 ; Lani et al., 2016 ; Ahola et al., 2011).

Table des matières

INTRODUCTION GÉNÉRALE
PARTIE 1 : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I – LE VIRUS DU ROSS RIVER
I.1 Arbovirus du Ross River
I.1.1 – Les arboviroses
I.1.2 – Impact des arboviroses
I.1.3 – Les alphavirus
I.2 Vecteurs et modes de transmission
I.2.1 – Les vecteurs
I.2.2 – Les réservoirs
I.2.3 – Cycles de transmission du virus
I.3 Epidémiologie
I.3.1 – Premières épidémies du RRV
I.1.1 – Distribution du virus en Australie
I.3.2 – Distribution du virus dans le Pacifique
I.4 Physiopathologie
I.4.1 – Symptômes et manifestations cliniques
I.4.2 – Immunologie chez le modèle de la souris et les patients humains
I.5 Biologie du virus
II – LA LUTTE CONTRE LE VIRUS DU ROSS RIVER
II.1 — Les répulsifsLes répulsifs
II.1.1 – Les répulsifs cutanés
II.1.2 – Les répulsifs synthétiques
II.1.3 – Les répulsifs naturels
II.1.1 – Mécanismes d’action
II.1.2 – Avantages et limites des répulsifs synthétiques et naturels
II.2 — VaccinsVaccins
II.3 — Les antivirauxLes antiviraux
III – LES HUILES ESSENTIELLES REPULSIVES
III.1 — Cymbopogon citratusCymbopogon citratus
III.1.1 – Composition de l’huile essentielle
III.1.2 – Ethnopharmacologie
III.2 — Pelargonium graveolensPelargonium graveolens
III.2.1 – Composition de l’huile essentielle
III.2.2 – Ethnopharmacologie
III.3 — Vetiveria zizanioidesVetiveria zizanioides
III.3.1 – Composition de l’huile essentielle
III.3.2 – Ethnopharmacologie
PARTIE 2 : RESULTATS
I – CARACTERISATION CHIMIQUE DES HUILES ESSENTIELLES
I.1 — Cymbopogon citratusCymbopogon citratus
I.2 — Pelargonium graveolensPelargonium graveolens
I.3 — Vetiveria zizanioidesVetiveria zizanioides
II – CARACTERISATION BIOLOGIQUE
II.1 — CytotoxicitéCytotoxicité
II.1.1 – Protocole optimisé pour les huiles essentielles
II.1.2 – Comparaison des tests colorimétriques courants de cytotoxicité
II.2 — Activité antiviraleActivité antivirale
II.2.1 – Permissivité des lignées cellulaires au virus du Ross River (RRV-T48)
II.2.1 – Mise au point d’un modèle d’étude pour le suivi de la réplication virale
II.2.2 – Effet cytoprotecteur des huiles essentielles
II.2.3 – Effet des huiles essentielles sur l’entrée du virus
II.2.4 – Effet des huiles essentielles sur la réplication virale
II.3 — Activité immunoActivité immuno–modulatoiremodulatoire
II.3.1 – Quantification des cytokines pro-inflammatoires et expression de leurs gènes
II.3.2 – Investigation des voies de l’inflammation impliquées lors d’une infection au RRV
PARTIE 3 : DISCUSSION
I – RENDEMENT DES HUILES ESSENTIELLES
II – PROFIL CHIMIQUE DES HUILES ESSENTIELLES
III – TOLERANCE CELLULAIRE DES HUILES ESSENTIELLES
IV – MECANISME D’ACTION ANTIVIRALE
V – MODULATION INDUITE DE L’IMMUNITE CUTANEE
PARTIE 4 : MATERIEL ET METHODES
1. MATERIEL VEGETAL
2. PREPARATION DES HUILES ESSENTIELLES
3. FRACTIONNEMENT DE L’HUILE ESSENTIELLE DE CITRONNELLE
4. CARACTERISATION CHIMIQUE
5. CULTURE CELLULAIRE
6. TEST MTT
7. TEST CRISTAL VIOLET
8. COLORATION AU BLEU DE TRYPAN
9. VIRUS
10. TITRAGE PAR PLAGES DE LYSE
11. IMMUNOFLUORESCENCE
12. FLUORESCENCE
13. BIOLUMINESCENCE
14. TRAITEMENT DES CLONES MOLECULAIRES AUX UV
15. EFFET CYTOPATHIQUE DES HUILES ESSENTIELLES
16. ACTIVITE VIRUCIDE DES HUILES ESSENTIELLES SUR RRV-T
17. DETERMINATION DE L’EFFET DES HUILES ESSENTIELLES SUR L’ENTREE DU VIRUS
18. TEMPS D’ADDITION – DIFFERENTS SCENARIOS
19. DOSAGE DES CYTOKINES PAR QRT-PCR
20. QUANTIFICATION DES CYTOKINES PAR ELISA
21. SYSTEME DE GENE RAPPORTEUR POUR LA VOIE NF-ΚB
22. ANALYSE STATISTIQUE
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES

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