Archaea méthanogènes et protozoaires de la cavité buccale

La parodontite

La parodontite est une maladie inflammatoire d’origine infectieuse. Elle affecte les tissus qui soutiennent les dents. L’ensemble de ces tissus est nommé « parodonte ». Ces tissus comprennent la gencive, le desmodonte, le cément et l’os alvéolaire.
Elle débute généralement par une gingivite qui est une inflammation de la gencive, puis s’étend progressivement vers le tissu osseux en formant des « poches parodontales » caractérisées par une perte d’attache. Une gingivite est réversible. En général, il ne reste pas de séquelle après traitement de la gingivite et mise en place de nouvelles habitudes de nettoyage. A l’inverse les pertes de substance osseuse provoquées par la parodontite aboutiront à un déficit permanent, qui pourra être corrigé ou non par un traitement chirurgical en fonction des différentes situations cliniques.
En l’absence de traitement, les parodontites peuvent être responsables de la destruction des tissus de soutien de la dent, entraînant des mobilités accrues, des migrations dentaires, ou, pourront aller jusqu’à la perte spontanée de la dent. Ces conséquences diminueront la capacité masticatoire et joueront un rôle négatif dans la fonction et l’esthétique global du patient. D’autres symptômes et signes cliniques peuvent être observés ou non comme la présence d’une inflammation, des saignements gingivaux spontanés ou provoqués, la présence d’abcès parodontaux, de récessions gingivales ou un phénomène d’halitose. Il existe plusieurs formes de parodontites et leur classification a longtemps été débattue. Les spécialistes parlent préférentiellement de «maladies parodontales», qui regroupent toutes les atteintes du parodonte. En accord avec les recommandations de l’ANAES, on utilisera la classification de l’Académie Américaine de Parodontologie.
Elle propose de répartir ces maladies en 8 groupes principaux : Maladies gingivales, Parodontites chroniques, Parodontites agressives, Parodontite manifestation d’une maladie systémique, Parodontites ulcéro-nécrotiques, Abcès parodontal, Parodontite associée à une pathologie endodontique, Anomalies bucco-dentaires acquises ou congénitales en rapport avec des maladies parodontales.

Trichomonas tenax

Un protiste est un microorganisme eucaryote à organisation cellulaire dite simple, le plus souvent unicellulaire, parfois pluricellulaire mais sans tissu spécialisé. Parmi ces protistes, on retrouve Trichomonas tenax qui est présent dans la cavité buccale de l’homme .
Les trichomonas sont des parasites communs à de nombreuses espèces de vertébrés et d’invertébrés. Quatre espèces sont classiquement considérées comme des parasites humains: Dientamoeba fragilis, Pentatrichomonas hominis, Trichomonas vaginalis et Trichomonas tenax. Les deux dernières espèces sont considérées comme spécifiques à l’homme. Par contre, D. fragilis et P. homini ont été aussi isolés chez des mammifères domestiques et d’élevage . Les trichomonas sont des protistes flagellés et anaérobies appartenant aux groupes vastes et divers que sont les Trichomonadea et Tritrichomonadea du phylum Parabasalia. Ils se caractérisent par la présence de trois à cinq flagelles antérieurs, des hydrogénosomes qui sont des organites produisant de l’hydrogène correspondant à des versions anaérobies de la mitochondrie, un corps parabasal (un grand Golgi) et un cytosquelette complexe. Quelques espèces ont été isolées à partir d’échantillons environnementaux et peuvent représenter des espèces vivant librement. Cependant, la majorité des espèces forment des interactions symbiotiques avec divers hôtes animaux Tricomonas tenax est le plus petit des Trichomonas de l’homme, 6 à 8 microns de long sur 5 à 6 de large. Il possède un axostyle long et grêle, 4 flagelles antérieurs et un flagelle récurrent soulevant une membrane ondulante jusqu’aux deux tiers du corps.

Les archaea méthanogènes

Jusqu’au XXème siècle, la plupart des biologistes considéraient que tous les êtres vivants pouvaient être classés en deux domaines : plante ou animal.
Mais dans les années 1950 et 1960, ils se sont rendus compte que ce système n’était pas adapté aux champignons, aux protistes et aux bactéries. Des travaux ont été réalisés par Carl Woese et George Fox à la fin des années 70.
Ils ont révélé que le monde vivant n’était pas divisé en deux domaines (Procaryotes et Eucaryotes), mais en trois domaines. Le premier groupe de procaryotes, qu’ils baptisèrent Eubacteria (eu = vrai) regroupait la plupart des bactéries ainsi que celles extraites des mitochondries et des chloroplastes eucaryotes. Le deuxième groupe rassemblait quelques bactéries anaérobies strictes capables de produire du méthane comme déchet de leur métabolisme (méthanogénèse).
A cause de leur métabolisme singulier, supposé être très primitif sur la base de modèles de la composition de l’atmosphère terrestre ancienne (il y a 3-4 milliards d’années) et possiblement présent chez les premières formes de vie, Fox et Woese baptisèrent ce groupe Archaebacteria. Le dernier groupe était constitué des quatre règnes eucaryotes (plantes, animaux, champignons et protistes), qui possèdent des traits communs tels que les noyaux, les cytosquelettes ou encore les membranes internes. Les archaea sont des microorganismes unicellulaires procaryotes, c’est à-dire des êtres vivants constitués d’une cellule unique qui ne comprend ni noyau ni organites, à l’instar des bactéries. Ce groupe d’organismes était à l’origine considéré comme des bactéries extrêmophiles particulières (ce qui explique le nom initial de « archaebacteria »), en raison de leurs similitudes physiques jusqu’à ce que les recherches phylogénétiques sur les procaryotes aboutissent, avec les travaux de Carl Woese et George E. Fox, à la publication en 1977 d’un arbre phylogénétique fondé sur les séquences des gènes d’ARN ribosomique des organismes étudiés, arbre dans lequel les procaryotes étaient scindés en deux domaines distincts, celui des bactéries et celui des archaea. Quelques années plus tard, Woese proposa d’enlever le suffixe « bacteria » au mot archaebacteria, afin de souligner les différences évolutives profondes séparant ces deux domaines, et les trois domaines devinrent : Archaea, Bacteria, et Eucarya. Du point de vue de leur génétique, leur biochimie et leur biologie moléculaire, les archaea sont des organismes aussi différents des bactéries que des eucaryotes. En effet, la structure lipidique de leur membrane est complètement différente de celle des autres organismes; les lipides membranaires des archaea consistent en de longues chaînes d’alcool isopréniques attachées au glycérol par des liaisons éther, alors que les autres organismes fabriquent les lipides de leurs membranes en assemblant deux chaînes d’acides gras avec une molécule de glycérol par l’intermédiaire d’une liaison ester. D’autre part, la transcription et la traduction chez les archaea sont plus proches de celles des eucaryotes que de celles des bactéries. Les archaea méthanogènes utilisent le dioxyde de carbone ou d’autres composés organiques simples, et l’hydrogène, pour produire du méthane, un processus appelé méthanogenèse. Ce métabolisme, qui semble fait sur mesure pour l’atmosphère terrestre primitive, explique le choix initial fait par Carl Woese du terme archéobactérie. La méthanogenèse est en fait un mécanisme très complexe qui met en jeu des coenzymes spécifiques et qui n’existe que chez les archaea.

Hybridation in situ par fluorescence (FISH)

L’hybridation fluorescente in situ (FISH) est une méthode de détection utilisée pour cibler les acides nucléiques (ARN et ADN) dans les cellules et les tissus. Cette méthode utilise des sondes marquées au fluorochrome complémentaire de la cible, ainsi que la microscopie à fluorescence. Pour cette étude nous avons utilisé un protocole dérivé d’un protocole de FISH pour des bactéries. Un volume de 10 µL de l’échantillon a été déposé sur une lame de verre, mis à sécher à l’air ambiant, puis fixé avec 20 µL de paraformaldéhyde à 4% pendant trente minutes. Ensuite, un volume de 20 µL d’une solution de lysosyme (Sigma) à 10g/L a été ajouté à l’échantillon. Ce mélange est incubé trente minutes à 37°C. Puis 5 µL de protéinase K (Sigma) ont été ajoutés ; l’ensemble a été incubé pendant encore cinq minutes, à 37°C. Après lavage de la lame avec de l’eau distillée, il a été incorporé : un volume de 10 µL d’une solution contenant 1 µL de la sonde Arch915 marquée au Alexa fluor-546 et qui est spécifique du gène de l’ARNr 16S Archaeal (10 µmol/L), 1 µL de la sonde mcrA (10 µmL/L), 5 µL de tampon d’hybridation (4x SSC, 10% de sulfate de dextrane, 1 mM d’EDTA, 25% de formamide, 300 ng/mL d’ADN de sperme de saumon et 1x solution de Denhart) ( Sigma-Aldrich), 1 µL de solution contenant 0,1% de Tween 20 et 0,1% deTriton X-100 (Euromedex, Souffelweyersheim, France), 2 µL d’eau distillée
Ensuite, la lame de verre a été recouverte d’une lamelle collée avec de l’adhésif Fixogum ( Marabu, Bietigheim-Bissingen, Allemagne). Elle est incubée à 65°C pendant dix minutes, puis à 37°C pendant vingt heures. Une fois le processus d’hybridation terminé, la lame est immergée dans une série de bains de citrate de sel de sodium (4X, 2X, 1X et 0,5X) pendant cinq minutes dans chaque bain à température ambiante. Enfin, la lame est recouverte d’une lamelle couvre-objet et observée à l’agrandissement 100 fois à l’aide d’un microscope à fluorescence (Leica DMI 6000, Nanterre, France).

Table des matières

I Introduction
I.1 La parodontite
I.2 Trichomonas tenax
I.3 Les archaea méthanogènes
II Matériel et méthode
II.1 Les données médicales
II.2 Les prélèvements
II.3 Extraction de l’ADN
II.4 Biologie moléculaire
II.5 Hybridation in situ par fluorescence (FISH)
III Résultats
III.1 Les prélèvements
III.2 Recherche de protozoaire à l’état frais
III.3 Mise en culture des prélèvements
III.4 Détection moléculaire d’archaea méthanogènes
III.5 Hybridation in situ par fluorescence (FISH)
IV Discussion
V Annexes
VI Bibliographie