Matériel et méthode de mesure de l’activité biologique

Matériel et méthode de mesure de l’activité biologique

Le but fixé est l’analyse de l’effet de l’inoculum sur la concentration en antibio- tique minimale nécessaire à l’inhibition de la croissance microbienne (CMI). Nous allons donc examiner l’effet de la concentration en antibiotique sur la croissance bactérienne.La micro-fluidique digitale a ouvert la voie vers des méthodes alternatives ef- ficaces et simples, vouées à l’étude d’un large panel d’échantillons. Les volumes de gouttes manipulés pour l’étude des phénomènes de groupes (inoculums larges) rend la milli-fluidique plus adaptés comme outils à nos études. Les rectifications etaméliorations techniques à apporter établissent le principe de la technologie déve- loppée : la co-encapsulation de bactéries avec un antibiotique, et la mesure de la croissance des organismes. L’outil est élaboré dans le but de concevoir des échan- tillons de cultures biologiques, indépendants les uns des autres, contrôlés finement en composition. Ces échantillons sont également identifiés et leur suivi individuel au cours du temps, ainsi que la sélection de quelques échantillons, sont possible. La manipulation (par pousse-seringues et électrovannes) et la mesure (par un PMT) des échantillons étant pilotés par ordinateur (figure 3.1 p.84).céphalosporines, appartenant à la famille des -lactamines. Les céphalosporines inhibent l’élaboration de la paroi bactérienne par le cycle -lactame, engendrant ainsi l’accumulation de composés au sein de la cellule ce qui conduit à la lyse des organismes visés.

En micro-biologie l’évaluation de la croissance microbienne se fait communé- ment par mesure de la densité optique au cours du temps. En effet, pendant la croissance, le milieu devient de plus en plus trouble lorsque les bactéries s’y dé- veloppent. La mesure par absorbance s’est avérée ne pas être assez sensible à la lecture de l’accroissement de la population bactérienne en milli-fluidique tubulaire.Ceci est dû à la trop faible longueur du chemin optique de l’échantillon : égale au diamètre des tubes dans lesquels nous formons les gouttes (0; 5 mm). De plus, cette méthode de mesure ne permet pas de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. Les techniques de manipulations génétiques permettent de modifier le génomedes bactéries. Ces procédés rendent les bactéries capables de synthétiser des pro- téines fluorescentes [27]. Les bactéries étudiées dans la totalité des travaux de cette thèse sont des Escherichia coli (E.coli ) fluorescentes par une synthèse de protéines dont le pic d’excitation est à 514nm et le pic d’émission à 527nm. Ce sont des souches YFP modifiées génétiquement, c’est à dire que la synthèse de fluoro- phores est dans leur génome. La lecture par fluorescence n’intègre que le signal des cellules viables, car les fluorophores ne sont pas synthétisée par les cellules mortes.E.coli est considéré depuis près de 70 ans comme un micro-organisme mo- dèle [27]. Cet organisme est facile à cultiver, il est hétérotrope et prototrophe, ce qui veut dire qu’il a un besoin absolu d’une source de carbone organique comme source énergétique et de biomasse, mais qu’il n’a besoin d’aucun autre métabolite organique (acides aminés, vitamines, etc…). De plus la culture peut être effectuée sans apport de dioxygène car c’est un organisme anaérobie facultatif. L’absence d’oxygène diminue seulement le taux de division de la bactérie.

Dans notre cas, la source nutritive utilisé est le Lysogeny Broth (LB). Il est, à ce jour, l’un des milieux les plus utilisés pour le maintien en vie et la culture de lignées d’E. coli. Ce milieu de culture est un milieu riche en nutriments pour la croissance bactérienne dilués dans de l’eau stérilisée.Comme décrit dans le chapitre précédent (section 2.2.3 p.67), les gouttes sont des chambres de réactions très pratiques et aisément concevables. Comme en micro- fluidique, la taille des gouttes est contrôlée principalement par les débits des phases imposés. Lorsque la jonction en T est choisie, seuls les débits imposés influencent la taille des gouttes (figure 3.3 p.87).L’émulsion est formée avec deux fluides non miscibles. Les fluides sont trans- portés à débits constants à travers des capillaires en PEEK jusqu’à la géométrie de formation de gouttes (figure 2.21 p.78). Les débits sont contrôlés par des pousse- seringues.C’est la mouillabilité de la surface par les fluides qui détermine quel fluide est la phase dispersée et lequel est la phase continue. La phase dispersée est le milieu de culture des organismes. La phase continue est l’huile fluorée HFE-7500 (3MTMNovecTM), grâce à sa grande mouillabilité envers les matériaux en Téflon de formation et de transport de gouttes. Les jonctions en T et les tubes transpor- tant les gouttes sont respectivement du PTFE et du FEP. Afin de prévenir des problèmes de stabilité d’émulsion, de fuites de certains composants et la compati- bilité biologique, nous utilisons un tensioactif : le PFPE-PEG [48] développé par RaindanceTM Technologies à 0; 005% en masse (CMC à 0; 1%).