Méthodes microbiologiques Milieu de culture

Méthodes microbiologiques Milieu de culture

Tests de biodégradation aérobie

Mise en œuvre du test

Les essais sont réalisés dans des fioles de pénicilline de 120 mL. Pour chaque souche, quatre essais contenant 10 mL de milieu de culture (MMSYE), 0,5 mL de HMN et 5 µL de 2- EHN (soit 487 mg.L-1) sont mis en œuvre. Deux témoins abiotiques, additionnés de chlorure mercurique à 0,2 mg.L-1 et deux témoins endogènes (absence de 2-EHN et présence de HMN dans le milieu de culture), sont réalisés. Deux fioles d’essais et de témoins endogènes sont aussi mises en œuvre dans les mêmes conditions afin de vérifier si la souche est capable de croissance en l’absence de HMN. Une fois ensemencées à D.O.600 = 0,2 les fioles sont incubées à 30°C, sous agitation. Au cours de l’incubation, le CO2 est régulièrement dosé dans le ciel gazeux de l’une des fioles d’essai ainsi que de l’une des fioles témoin sans substrat, avec ou sans HMN. A l’issue de 28 jours d’incubation (temps de dégradation préconisé dans les normes ISO 14593), les milieux de culture sont acidifiés avec 1 mL d’HCl 17,5%. Les fioles sont agitées pendant une nuit, puis le CO2 est dosé afin d’en déterminer la quantité finale. Le 2-EHN résiduel est alors extrait pendant 30 mn sous agitation, (volume à volume) par du MTBE contenant de décahydronaphtalène 5% (v/v) utilisé comme standard interne. Les fioles sont alors refroidies au minimum 1h à 4°C puis 2 mL de la phase organique sont prélevés et dosés par CPG/FID. Pour tous les calculs relatifs aux tests de biodégradation, la respiration endogène mesurée dans les fioles sans 2-EHN est systématiquement déduite de celle mesurée dans les essais. Chaque test est réalisé en triplicata. Les résultats sont exprimés en faisant la moyenne et l’écart type des trois essais.  

Expression des résultats

Taux de recouvrement abiotique

Le taux de recouvrement abiotique correspond à la quantité de substrat dosé par CPGFID dans les témoins abiotiques en fin de culture par rapport à la quantité de substrat introduit déterminé par le calcul (masse volumique du substrat multipliée par le volume introduit). Ce calcul permet de vérifier l’étanchéité des fioles utilisées ainsi que de valider les calculs du taux de dégradation et du rendement de minéralisation qui prennent en compte les valeurs des concentrations en substrat résiduel.

Taux de dégradation

Le taux de dégradation est déterminé grâce aux analyses CPG/FID par le rapport entre la quantité de substrat consommé dans les essais et celle présente dans les témoins abiotiques à la fin de la période d’incubation. 1.3.2.3 Rendement de minéralisation Le rendement de minéralisation est le rapport entre le nombre de moles de carbone dégagées sous forme de CO2 (dosé par CPG à détection catharométrique après acidification en tenant compte du CO2 dissous) et le nombre de moles de carbone du substrat consommé (déterminé par la différence entre le substrat introduit initialement et le substrat résiduel présent dans les essais et dosé par CPG/FID), en tenant compte du rendement d’extraction (taux de recouvrement). Le nombre de mole de CO2 dégagé dans les fioles témoins sans substrat (respiration endogène) est déduit de la quantité de CO2 déterminée dans les essais.

Suivi cinétique de la consommation d’oxygène par respirométrie

Le Sapromat est un appareil de respirométrie qui mesure de manière indirecte la consommation d’oxygène (Sapromat D12-S, Voith, Allemagne). Il est composé de 12 postes dont le principe de fonctionnement est le suivant (Figure 3.1) : Une fiole d’essai de 500 mL en communication directe avec un générateur d’oxygène, est séparée d’un compartiment de référence par un manomètre. L’ensemble, placé dans un bain marie à 30°C sous agitation magnétique, est indépendant des variations de pression atmosphérique et de température extérieure. L’activité des microorganismes crée une consommation d’oxygène et une production de CO2. Le CO2 est piégé par de la chaux sodée en excès. Toute activité métabolique génère donc une dépression. Cette dernière crée un contact entre les deux électrodes du manomètre, qui entraîne alors une production d’oxygène par voie électrolytique. Lorsque l’équilibre de pression est rétabli, le contact manométrique  ainsi que la production d’oxygène cessent. La mesure de consommation d’oxygène est fournie par celle de la quantité d’électricité consommée par le générateur électrolytique. L’unité de stimulation du générateur (86 mA pendant 36 s) représente 0,25 mg d’oxygène produit. Les données sont analysées par le logiciel informatique fourni par le constructeur (Sapromat). Après croissance en MSMYE sur Tween 80 (2,5 g.L-1), les cellules sont centrifugées à 10 000 g pendant 10 mn puis lavées une fois en MMSYE sans substrat carboné. Le culot cellulaire est repris dans 250 mL de milieu de culture (MMSYE) avec ou non 5% de HMN (Sigma) ou 5% d’huile de silicone (47V20, Prolabo, France) de façon à obtenir une D.O.600 initiale proche de 0,1. Les fioles sont alors introduites dans l’appareil Sapromat