Fonctionnement général du test NovoDiag® Stool

Fonctionnement général du test NovoDiag® Stool

Parasite Novodiag® Stool Parasites est un test de diagnostic moléculaire in vitro qualitatif et automatisé permettant de détecter la présence de marqueurs d’acides nucléiques de trente pathogènes parasitaires et fongiques intestinaux: protozoaires, helminthes et microsporidies les plus courants dans les échantillons de selles. En combinant les technologies de PCR en temps réel et de puces à ADN, Novodiag® Stool Parasite permet l’analyse directe de l’échantillon d’un patient placé dans une cartouche à usage unique, pour un dépistage complet de pathogènes multiples. Vingt-six cibles sont analysées dans un même run. Les résultats sont exprimés de manière qualitative (positif ou négatif) pour chaque parasite. Il présente également l’avantage d’être relativement facile d’utilisation, et ne nécessite pas l’intervention d’un opérateur expérimenté. III. Protocole d’analyse NOVODIAG® Stool Parasite Il a été établi par le fournisseur. Tout d’abord, la première étape consiste à prélever un échantillon de selle à l’aide d’un écouvillon. Cinq endroits différents ont été prélevés au sein d’un même échantillon, dans le but d’avoir une prise d’essai la plus homogène possible afin de pouvoir gagner en sensibilité (en raison du faible de nombre de parasites présent dans certains cas). Ensuite, l’écouvillon a été placé dans le milieu de transport fourni puis vortexé durant une dizaine de secondes. La totalité du contenu a ensuite été transféré dans un tube stérile contenant des billes en céramique, lui aussi fourni par Novodiag® Stool Parasite, puis placé dans un automate de type FastPrep, pour une durée de 90 secondes à 7 000 tours/min. Enfin, 600 microlitres de solution finale ont été prélevé pour être déposé directement dans la cassette Novodiag® Stool Parasite. A noter que le jour de décongélation de la selle pour l’analyse, un échantillon a été envoyé en parallèle pour réaliser une nouvelle extraction de matériel génétique en routine. Cela a permis de s’affranchir du « biais de congélation/décongélation», et ainsi éviter un faux négatif IV. PCR simplex routine Un nouvel extrait d’ADN (différent de celui utilisé lors du diagnostic positif) a été obtenu pour chacune des selles passées dans le Novodiag® Stool Parasite. Les extraits d’ADN sont obtenus après un passage dans le FastPrep suivi d’une extraction NucliSens® easyMAG™ selon les recommandations du fournisseur. Ensuite, nous avons réalisé un ensemble de PCR simplex sur ces nouveaux extraits. L’ensemble des PCR dont nous disposons au laboratoire sont listés dans l’Annexe 4 Les systèmes PCR ainsi que le tableau de préparation des différents mix sont listés dans les Annexes 7 et 8. V. Caractéristiques de la population test (annexe 9) Différentes données relatives aux vingt-six patients étudiés ont pu être recensés grâce à un recueil des données clinico-biologiques sur les logiciels NextLab et Axigate. Vingt-six patients ont fait partie de la cohorte d’étude. La répartition homme/femme était de dix-sept hommes et neuf femmes, ce qui correspond à un sex-ratio de 1.9. Concernant les services cliniques d’origine des malades, trois proviennent du service d’accueil des urgences, dix malades ont été pris en charge par les consultations/hospitalisation de l’IHU et trois autres étaient hospitalisés en réanimation/soins intensifs. Parmi les autres services cliniques, les patients étaient admis en chirurgie pédiatrique (n= 1), en hématologie pédiatrique (n= 1), en gériatrie (n= 1), en neurologie (n= 1), en chirurgie générale (n= 2), en unité COVID-19 (n= 2). Deux patients provenaient d’un établissement extérieur à l’Assistance publique des hôpitaux de Marseille (AP-HM). Cliniquement, neuf personnes ont présenté un tableau de diarrhées, quatre ont présenté des symptômes de type nausées et/ou vomissements. Aucune information clinique n’a pu être récupérée pour six personnes. Concernant le statut immunodépression, cinq patients sont immunodéprimés: quatre transplantés (3 transplantations rénale et 1 transplantation hépatique) et un patient au stade sida. Seize patients sont sans immunodépression et cinq pour lesquels les données sont manquantes. 34  En ce qui concerne le reste du bilan biologique, sept présentaient une hyperéosinophilie (de 0.7-1.9 x 109G/L), treize absence d’hyperéosinophilie, six données manquantes. La notion de pays d’origine, de retour de voyage a systématiquement été recherchée dans le recueil de données. Seize patients n’ont pas de notion de voyage dans leur dossier. Trois personnes ont une histoire de voyage, le patient 11 au Laos, le patient 31 au Soudan et le patient 33 en Angola. Quatre personnes expatriées, le patient 18 originaire de Bosnie, le patient 19 originaire des Comores, le patient 22 originaire d’Algérie et le patient 32 originaire de Thaïlande ont été inclus dans l’étude. Deux patients sont originaires d’Outre-Mer (patient 17 et patient 30). Le patient 13 est un migrant provenant d’Ethiopie, arrivé en France en 2017 après un passage par le Soudan, la Libye et l’Italie.

 Résultats

 Au final trente-six échantillons ont été analysés par PCR multiplex NovoDiag® Stool Parasite, dix témoins négatifs et vingt-six patients tests. Les résultats par parasites recherchés par le système NovoDiag® sont détaillés individuellement ci-dessous et résumé dans le tableau 2.

Ascaris lumbricoides

Une selle positive à Ascaris lumbricoides, après examen direct microscopique a été inclue dans notre étude, correspondant au patient 18. La PCR NovoDiag® Stool Parasite a confirmé le résultat obtenu, tout comme notre PCR routine. L’histoire clinique est celle d’un enfant de 3 ans originaire de Bosnie adressé aux Urgences de la Timone, car sa maman a retiré un ver blanc rosé de la narine gauche. Les EPS ultérieures ont mis en évidence les œufs d’A. lumbricoïdes.

Blastocystis spp. 

Au total, trois échantillons positifs (patients 19, 26 et 27) ont été retenus après examen parasitologique des selles. Ces trois échantillons ont été confirmés positifs par le NovoDiag® Stool Parasite. Sur nos trente-six échantillons le NovoDiag® Stool Parasite est revenu positif à Blastocystis spp, pour quatorze patients dont deux du groupe témoins négatifs. Parmi ces positifs (n=14), nous retrouvons sept cas de co-infection : Dientamoeba fragilis (n=5), Giardia intestinalis (n=1), et un à Taenia saginata/asiatica ET à Schistosoma mansoni. Tous les patients positifs à Blastocystis spp. au NovoDiag® Stool Parasite (n = 14) ont été confirmés positifs par notre PCR routine.

Cryptosporidium spp 

Nous n’avions qu’un seul patient positif à Cryptosporidium spp (confirmation de l’espèce : C. parvum) par PCR routine, qui a été retrouvé positif par le NovoDiag® Stool Parasite (patient 24). Ce cas correspond à un patient au stade sida (250 CD4/mm3) qui avait présenté des diarrhées profuses. 37  IV. Entamoeba histolytica En ce qui concerne E. histolytica, les résultats sont plus contrastés. Cinq échantillons positifs par PCR routine ont été inclus (patients 14,21, 32, 33,34). Parmi eux, quatre étaient également positifs à l’examen direct, avec présence de formes kystiques pour les trois échantillons, et présence de formes kystique et végétative pour un échantillon (patient 14). Seul l’échantillon 32 avait un examen direct négatif, le diagnostic avait été réalisé par la PCR routine. Aucun de ces cinq échantillons n’a été confirmé par le kit NovoDiag® Stool Parasite. La PCR routine réalisée sur le nouvel extrait d’ADN contemporain au test NovoDiag® Stool Parasite est bien revenu positive pour les cinq échantillons. Nous pouvons écarter la cause d’une mauvaise conservation de l’échantillon. Pour les patients 14, 32, 33 et 34, Blastocystis spp a été détecté par le kit NovoDiag® Stool Parasite et confirmé par notre PCR routine. L’examen direct était négatif. Les patients 32 et 33 ont été rendu positifs à Dientamoeba fragilis par le kit NovoDiag® Stool Parasite et également confirmé par notre PCR routine. L’examen direct était négatif. 

Microsporidies /Enterocytozoon bieneusi

 Un échantillon positif par PCR routine a été retrouvé par le NovoDiag® Stool Parasite (patient 28). Ce cas correspond à un patient greffé rénal qui avait présenté des diarrhées liquidiennes persistantes sans autres étiologies retrouvées. 

Giardia intestinalis 

Huit prélèvements ont été inclus. Quatre ont été diagnostiqués par PCR routine et quatre par PCR multiplex par le kit Gastrointestinal Panel FilmArray® du BioFire. L’EPS a pu être réalisé sur sept de ces échantillons : six étaient positifs (kystes ± formes végétatives), dont un cas de co-infection avec blastocystis spp. L’examen direct négatif (patient 31) : la PCR routine était positive tardivement, pouvant expliquer l’examen direct négatif. Après analyse dans le NovoDiag® Stool Parasite, sept échantillons sur huit ont détectés la présence de Giardia intestinalis. Le négatif NovoDiag® Stool Parasite correspond au patient 19 avec un examen direct et un Gastrointestinal Panel FilmArray® BioFire positifs.