Criblage chimique sur chromatographie sur couche mince

Historique

Le Shiitake nom commun japonais de Lentinula edodes (Berk.) Pegler, est l’un des champignons comestibles les plus cultivés et les plus consommés au monde (Kitzberber et al., 2007). Le nom Shiitake est dérivé de deux mots : « Shii ≫ designe l’arbre sur lequel il pousse (Castanopsis cuspidata) et « Take » signifie champignon (Taithe, 2016). Le Shiitake est un champignon présentant un pied pelucheux clair et un chapeau brun foncé et a été cultivé comme un champignon comestible depuis des siècles (Traore, 2005). En l’an 199 avant Jésus-Christ (J.-C.), on notait les premieres traces rapportant l’existence du Shiitake. A cette époque, une tribu indigène du japon appelée (Kyusuyu) offrit à l’empereur Chai un champignon Shiitake. Sa consommation fut également mentionnée dans les pratiques alimentaires du livre « Wang zhen nong shu », en Chine, sous la dynastie des Han (202 av. J.- C.). Sa culture a commencé et a été améliorée au Moyen âge, dans tout le sud-est asiatique grâce aux Chinois et aux Japonais (Hobbs, 1995) L’histoire et la légende attribuent à Wu San Kwung de la dynastie Song l’origine de la culture du Shiitake. Presque tous les villages producteurs de champignons en Chine ont un temple en son honneur (Miles et al., 1997).

En 1313, l’auteur chinois Wang Cheng dans son livre sur l’agriculture, mentionnait egalement les techniques de culture de Shiitake en decrivant comment choisir le site et les outils appropriés pour la culture de ce champignon (Przbylowicz et al., 1990 ; Laurent, 2004). Au cours de la dynastie Ming (1368-1644), Wu Ri (un célèbre médecin chinois) affirma que le Shiitake était un aliment possédant des propriétés bénéfiques sur la longévité, les performances énergétiques et sexuelles. De ce fait, plusieurs empereurs chinois le consommèrent de façon quotidienne pour ralentir le début du vieillissement. Il fut surnomme l’≪ Elixir de vie ≫ (Traore, 2005 ; Taithe, 2016) ou encore « champignon de longévité » (Pouyat, 2015). Les scientifiques découvrent aujourd’hui que les anciens guérisseurs et médecins chinois connaissaient bien les champignons médicinaux et que le Shiitake pourrait contribuer à combattre un ensemble de maladies, notamment les maladies cardiaques, le cancer et les maladies virales mortelles (Ying et al., 1987 ; Hobbs, 2000).

Glucides Chez

Lentinula edodes, on trouve des glucides assimilables par l’organisme humain et ceux non assimilables. Les glucides assimilables représentent environ 69 % du poids sec du champignon (Taithe, 2016). Parmi eux, le Shiitake contient entre 30 à 60 % d’alditol (polyol non cyclique), 2 à 8 % de tréhalose (diholoside), 1 à 4 % de glucose (hexose), ainsi que des pentoses (xylose et ribose) ou methyl pentose (rhamnose), d’autres hexoses (fructose, galactose et mannose), des diholosides (saccharose), des sucres aminés (glucosamine et Nacetylglucosamine), d’autres polyols (inositol), des acides uroniques (acide glucuronique et acide galacturonique), etc. (Ales et al., 2013 ; Taithe, 2016). La chitine fait partie de la famille des glucides non assimilables ; il s’agit d’un polysaccharide azoté (polymère de N-acetylglucosamine) représentant le constituant essentiel de la paroi cellulaire. Elle est très impliquée dans la solidité du champignon et participe à sa protection contre les agressions extérieures (Taithe, 2016). Notons qu’on peut trouver egalement d’autre groupe de polysaccarides tres benefiques pour la sante de l’homme dans la paroi cellulaire des champignons. Ces molecules polysaccharidiques sont appelées des « glucanes » et sont, essentiellement des β-glucanes. Ils sont constitués de molecules de glucoses liees par des liaisons beta. Ces liaisons peuvent etre β (1→3) ou β (1→6) (Bak et al., 2014).

Ils sont connus pour leur activité anti-tumorale, anti-inflammatoire, antioxydante et antivirale (Chang & Miles, 2004 ; Rathore et al., 2017). En plus de leur effet dans le systeme immunitaire, les β-glucanes peuvent participer aux processus physiologiques lies au metabolisme des graisses dans l’organisme. Leur utilisation entraine une nette diminution de la teneur en cholestérol dans le sang et contribuerait également à une réduction du poids corporel (Rop et al., 2009). Les β-glucanes sont retrouvés aussi dans la composition de la paroi cellulaire de certaines bactéries, ainsi que dans les céréales comme (avoine, seigle, orge) (Maheshwari et al., 2017 ; Pengkumsri et al., 2017). Chez le Shiitake, la teneur en β-glucanes est estimée environ à 22 mg/100g de matière sèche (Rop et al., 2009) avec 20,06 ± 1,76% à 44,21 ± 0,13% dans le sporophore et de 29,74 ± 1,40% à 56,47 ± 4,72% dans la section du stipe et varie en fonction des parties du champignon et de la souche utilisée (Bak et al., 2014). Une récente étude Allemande a montré aussi que la teneur en β-glucanes dans Shiitake se situe dans l’intervalle de 19 à 25 g de matière sèche (Sari et al., 2017). Le stipe contient des quantités plus élevées que le chapeau, qui en contient lui-même plus que le mycélium (Bak et al., 2014 ; Taithe, 2016). Lentinane

Les polyphénols

Les polyphénols (figure 4) sont des molécules produites par le métabolisme secondaire des végétaux et des champignons (Manallah, 2012). Ils possèdent au moins deux groupements phénoliques, avec parfois la presence d’autres fonctions (alcoolique, carboxylique…) (Muanda, 2010). A ce jour, environ 9 000 structures connues se regroupent dans cette famille de molécules, allant des substances phénoliques simples de bas poids moléculaire tels que, les acides phénoliques (Manallah, 2012) à des composés hautement polymérisés comme les tannins (Akowauh et al., 2004). Ils sont assez presents dans l’alimentation humaine et animale (Martin & Andriantsitohaina, 2002). Les polyphénols sont des véritables molécules antioxydantes et sont très abondants dans certains aliments (Kozarski et al., 2015b), notamment le thé (Hashimoto et al., 2003 ; Khan & Mukhtar, 2007), l’huile d’olive (Meroune et al., 2014 ; Benlemlih & Ghanam, 2016), les champignons, les fruits et légumes. Depuis des années, plusieurs chercheurs ont concentré l’essentiel de leurs efforts sur l’impact de la consommation des polyphenols dans la sante de l’homme (Scalbert et al., 2005a).

La diversité des composés identifiés et le large spectre de leurs activites biologiques constituent la principale difficulte d’elucidation des effets sante des polyphénols (Kuntz et al., 1999 ; Kozarski et al., 2015b). Au-dela du role fondamental que jouent les polyphenols dans la sante de l’homme, ces molécules sont également impliquees dans l’amelioration de la qualite sensorielle, organoleptique et nutritionnelle des végétaux, tels que les légumes, les fruits, les céréales ou les fruits secs, ainsi que dans les boissons notamment le café, le cacao ou le thé (Kozarski et al., 2015b). On estime que l’homme consomme environ un gramme de polyphénols chaque jour, soit dix fois plus que de vitamine C et 100 fois plus que de caroténoïdes ou vitamine E (Scalbert et al., 2005b). L’activité antioxydante des polyphénols est reconnue et pourrait expliquer leur rôle potentiel dans le traitement ou la prévention de plusieurs maladies associées au stress oxydatif (Kozarski et al., 2015b), telles que le cancer (Chen & Dou, 2008), les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives (Rahman et al., 2006 ; Rossi et al., 2008 ; Perez- Vizcaino & Duarte, 2010).

Les flavonoïdes

Les flavonoïdes (Figure 6) sont des molécules phénoliques et représentant une classe de métabolites secondaires largement répandus dans le règne végétal (Muanda, 2010). Ils sont responsables de la coloration des fruits, des fleurs et des feuilles. Ils sont dissous dans la vacuole des cellules à l’état d’hétérosides ou comme constituants de plastes particuliers, les chromoplastes (Muanda, 2010). On dénombre actuellement près de 6500 flavonoïdes et compte tenu des decouvertes, leur nombre ne cesse de s’accroitre encore (Stöckigt et al., 2002). La structure de base des flavonoïdes est un noyau de 15 atomes de carbone formé par deux cycles aromatiques (A et B) reliés par un hétérocycle oxygéné C, hexa- ou pentagonal (De Rijke et al., 2006 ; Muanda, 2010). Les six sous-classes communes de flavonoïdes sont les flavonols, les flavones, les isoflavones, les flavanones, les anthocyanidines et les flavanols (Manach et al., 2004 ; Farkas et al., 2004 ; Perez-Vizcaino & Duarte, 2010). De façon générale, on estime que seules les plantes possèdent la capacité de synthétiser ou de produire des flavonoides, alors que les animaux et les champignons n’en contiennent pas (Ferreira et al., 2009). Cependant, selon une étude Coréenne de 2008 et une autre réalisée en 2015 a l’universite de Belgrade (Serbie) montrent la presence effective de certains flavonoides comme : la catéchine, la chrysine, l’hesperetine, la myricétine, et la naringénine dans plusieurs champignons (Kim et al., 2008 ; Kozarski et al., 2015a).

La même année aussi, l’analyse de l’extrait méthanolique de Cantharellus cibarius a montré que les acides phénoliques étaient ses principaux composants antioxydants mais ils étaient suivis par les flavonoïdes (Kozarski et al., 2015a). Pour le Shiitake, les recherches menees ont montre la presence d’une teneur non negligeable en flavonoïdes. Parmi les flavonoïdes identifiés, on peut citer la rutine et les catéchines (Kim et al., 2008 ; Yildiz et al., 2015). D’autres auteurs (Mujić et al., 2010 ; Khaund et al., 2015) ont trouve respectivement 1,98 mg d’equivalent catechine par gramme d’extrait sec de champignon et 0,91 mg par gramme d’equivalent quercetine dans le Lentinula edodes. Ces flavonoïdes jouent un rôle très important dans l’organisme. Ils sont des veritables molecules antioxydantes capables de pieger les especes reactives de l’oxygene (ERO) (Perez-Viscaino et al., 2010). Ils participent également à la prévention des maladies cardiovasculaires. Selon Scalbert et al. (2005a), les flavonoides agissent aussi dans l’organisme en inhibant l’agregation plaquettaire impliquée dans le phénomène de thrombose qui peut conduire à l’occlusion des artères.

Table des matières

Résumé
Abstract
Dedicace
Remerciements
Liste des Publications et Communications
Liste des tableaux
Liste des figures
Liste des abréviations
Introduction
Première partie : Bibliographie et état de l’art sur le sujet de thèse
Chapitre I : Généralités sur Lentinula edodes
1.1 Introduction à la mycologie
1.1.1 Définition
1.1.2 Règne des fungi
1.1.3 Modes de vie des champignons
1.2 Aspect mycologique du Shiitake
1.2.1 Historique
1.2.2 Description mycologique
1.2.3 Cycle de reproduction
1.2.4 Taxonomie (Classification
1.3 Composition chimique
1.3.1 Macronutriments
1.3.2 Micronutriments
1.3.3 Les composés organiques volatiles
1.3.4 Les acides organiques
1.3.5 Les polyphénols
1.4 Culture du Shiitake
1.4.1 Exigences nutritionnelles et facteurs environnementaux pour sa culture
1.4.2 Les types de cultures
1.5 Conservation
1.5.1 Séchage
1.5.2 Congélation
1.5.3 Dans le vinaigre
1.5.4 Dans l’huile
2 Chapitre II : Propriétés biologiques
2.1 Activité antioxydante
2.1.1 Bref rappel du stress oxydant
2.1.2 Shiitake et activité antioxydante
2.2 Activité anti-inflammatoire
2.2.1 Rappel sur l’inflammation
2.2.2 Mécanismes cellulaires et moléculaires de l’inflammation
2.2.3 Types d’inflammation
2.2.4 Les médiateurs inflammatoires
2.2.5 Les anti-inflammatoires
2.2.6 Shiitake et activité anti-inflammatoire
2.3 Autres activités
2.3.1 Activité hypocholestérolémiante
2.3.2 Activités hypoglycémiantes
2.3.3 Activités anti-cancéreuses
2.3.4 Activités antibactériennes et antifongiques
2.3.5 Activité hépatoprotectrice
Deuxième partie : Travaux de thèse
1 MATERIEL ET METHODES
1.1 Produits chimiques
1.2 Matière fongique
1.3 Préparation des échantillons
1.4 Procédure d’extraction des molécules
1.5 Criblage chimique sur chromatographie sur couche mince
1.6 Caractérisation des extraits par Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP)
1.6.1 Analyse des polyphenols et de l’acide ascorbique
1.6.2 Identification et quantification de l’ergostérol
1.6.3 Identification de la lovastatine et de α-tocophérol
1.7 Carctérisation des extraits par chromatographie sur couche mince
1.7.1 Détection des acides phénoliques (Acide vanillique et acide gallique) et acide ascorbique
1.7.2 Identification de l’ergostérol et de l’α-tocophérol
1.7.3 Identification, séparation et quantification des acides aminés
1.8 Dosage des polyphénols totaux
1.9 Détermination du pouvoir antioxydant des extraits in vitro
1.9.1 DPPH
1.9.2 ORAC
1.10 Activité anti-inflammatoire
1.10.1 Mesure de la viabilité cellulaire par le test MTS/PMS
1.10.2 Effet des extrais sur la production de NO par les macrophages inflammatoires
1.10.3 Dosage du NO par la méthode de Griess
1.10.4 Activité NO scavenging des extraits
1.10.5 Effet des extraits sur la production de TNFa par les macrophages inflammatoires
1.10.6 Dosage du TNFa dans les surnageants de culture
2 RESULTATS
2.1 Extraction et rendement d’extraction
2.2 Criblage phytochimique par chromatographie sur couche mince (CCM)
2.3 Analyse des chromatogrammes par la chromatographie liquide à haute performance
2.4 Caractérisation des extraits par la chromatographie liquide haute performance
2.4.1 Caractérisation des acides phénoliques et de l’acide ascorbique
2.4.2 Identification de l’α-tocophérol
2.4.3 Identification et quantification de l’ergostérol
2.5 Caractérisation des extraits par chromatographie sur couche mince
2.5.1 Identification de l’acide ascorbique
2.5.2 Identification de α-tocophérol
2.5.3 Identification, séparation et quantification des acides aminés
2.6 Teneur en polyphénols totaux
2.7 Activité antioxydante des extraits
2.7.1 Activité antioxydante des extraits du Shiitake
2.7.2 2,2 diphényle-1-picryl-hydrazyl (DPPH)
2.7.3 Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC)
2.8 Activité anti-inflammatoire
2.8.1 Effet des extraits éthanoliques et aqueux du Shiitake sur la viabilité cellulaire
2.8.2 Effet des extraits sur la production de NO par les macrophages inflammatoires
2.8.3 Activité du NO scavenging des extraits éthanoliques et aqueux
2.8.4 Dosage du TNFα
3 DISCUSSION
3.1 Extraction
3.2 Polyphénols totaux
3.3 Activités antioxydantes
3.3.1 DPPH
3.3.2 ORAC
3.4 Activité anti-inflammatoire des extraits polaires sur les cellules J774.A1
3.4.1 Dosage du NO
3.4.2 Dosage du TNFα
Conclusion et perspectives
Références bibliographiques
Annexes
Annexe 1: Article 1
Annexe 2 : Communication orale
Annexe 3 : Poster 1
Annexe 4 : Poster 2
Annexe 5 : Poster 3
Annexe 6 : Poster 4

Cours gratuitTélécharger le document complet

Télécharger aussi :

Laisser un commentaire

Votre adresse e-mail ne sera pas publiée. Les champs obligatoires sont indiqués avec *