Tests de détection des familles chimiques

Tests de détection des familles chimiques

a) Alcaloïdes

Les alcaloïdes sont des composés organiques azotés présentant des propriétés alcalines plus ou moins marquées. Ils forment des précipités aves les sels de métaux lourds tels que le mercure, le bismuth et l’iode.

Test de MAYER
L’extrait acide contenu dans le deuxième tube est additionné de 4 à 5 gouttes de réactif de MAYER. La présence d’alcaloïdes est mise en évidence par la formation d’un précipité ou d’une floculation.

Test de WAGNER
Quatre à cinq gouttes de réactif de WAGNER sont ajoutées dans le troisième tube. L’apparition d’une floculation indique la présence d’alcaloïdes.

Test de DRAGENDORFF
L’apparition d’une floculation après ajout de 2 à 3 gouttes du réactif de DRAGENDORFF dans le dernier tube démontre la présence d’alcaloïdes .

Test de confirmation
Si les tests de détection des alcaloïdes sont positifs, un test de confirmation est nécessaire. Ceci consiste à solubiliser le précipité ou la floculation obtenu avec 0,5 ml d’éthanol 80% (80 ml d’éthanol absolu dans 100 ml de solution).

b) Flavonoïdes et leucoanthocyanes

La présence de flavonoïdes et leucoanthocyanes est détectée dans l’extrait hydroéthanolique.

Quatre tubes à essai contenant chacun 1ml d’extrait à tester sont utilisés. Le premier sert de témoin et les trois autres sont utilisés pour les tests.

Flavonoïdes: TEST DE WILLSTÄTER
Les flavonoïdes sont réduits en présence d’acide chlorhydrique concentré et de magnésium. Un volume de 0,5 ml de HCl 6 N et 2 tournures de magnésium sont ajoutés dans le deuxième tube. Le changement de couleur est noté après 10 min : une coloration rouge indique la présence de flavones, une coloration rouge pourpre celle de flavonols et une coloration rouge violacé celle des flavonones. La même opération est répétée dans le troisième tube. Le mélange est ensuite additionné de 1ml d’eau distillée et 0,5 ml d’alcool isoamylique. Après 10 min, 2 phases apparaissent. Le changement de couleur est observé au niveau de la phase supérieure. Les résultats se lisent de la même façon que ceux du deuxième tube.

Leucoanthocyanes : TEST DE BATE-SMITH
Les leucoanthocyanes forment en milieu acide des composés de coloration rouge. L’extrait du quatrième tube est mélangé à 0,5 ml de HCl 6 N. La solution est ensuite chauffée au bain-marie bouillant pendant 30 min. L’apparition d’une coloration rouge après refroidissement marque la présence des leucoanthocyanes.

c) Stéroïdes, triterpènes et stérols insaturés

Stéroides et triterpènes : Test de LIEBERMANN-BURCHARD
Ces composés possèdent un groupement OH en 3 protégé par addition d’anhydride acétique. Cette réaction est suivie soit d’une isomérisation soit d’une transposition moléculaire, provoquant un changement de coloration. L’extrait chloroformique est utilisé pour les tests. Trois gouttes d’anhydride acétique sont ajoutées à un 1 ml de l’extrait. Après une légère agitation, 1 ml d’acide sulfurique (H2SO4) 36 N sont versées le long de la paroi du tube incliné de 45°contenant le mélange. Le changement de la coloration est observé pendant 1 h. La coloration bleu-vert de la phase inférieure indique la présence de stéroïdes et l’apparition d’un anneau rouge violacé à l’interface marque la présence de triterpènes.

Les deux résultats peuvent être simultanément observés, indiquant la présence des deux composés.

Stérols insaturés : Test de SALKOWSKI
Les stérols insaturés forment une insaturation supplémentaire en présence d’un acide concentré, provoquant un virage de couleur en rouge. Un millilitre de H2SO4 36 N est versé le long de la paroi du tube à essai incliné de 45° contenant 1 ml d’extrait chloroformique. La réaction est positive s’il y a apparition d’un anneau rouge à l’interface.

d) Saponosides

Les saponosides se dissolvent dans l’eau en formant des solutions moussantes après agitation. L’extrait aqueux est utilisé pour leur détection. L’extrait à analyser est agité énergiquement pendant 30 s. Une mousse alvéolée apparait. Si celle-ci atteint une hauteur de 3 cm et persiste pendant au moins 30 min, l’extrait contient des saponines.

e) Tanins et polyphénols

Les tanins sont des composés pouvant précipiter les protéines comme la gélatine. L’extrait aqueux qui est utilisé, est réparti dans quatre tubes à essai à raison de 1 ml par tube. Le premier sert de témoin et les trois autres sont destinés aux tests.

Test à la gélatine
L’extrait dans le second tube est additionné de 5 gouttes de gélatine à 1% (p/v). La présence de tanins hydrosolubles est indiquée par l’apparition d’un précipité blanc.

Test à la gélatine salée
La formation d’un précipité après ajout de 5 gouttes de gélatine salée (10 g de NaCl dans 100 ml de gélatine aqueuse 1%) dans le troisième tube indique la présence de tanins condensés.

Test au chlorure ferrique
Quatre à cinq gouttes de chlorure ferrique en solution méthanolique sont ajoutées dans le quatrième tube. La présence de tanins est montrée par la formation d’un précipité.

Si le test à la gélatine est négatif alors qu’il y a apparition de coloration vert-noir ou bleu-noir lors du test avec le chlorure ferrique, cela signifie que d’autres composés polyphénoliques sont présents.

f) Désoxyoses : test de KELLER-KILIANI

Un millilitre d’extrait aqueux est additionné de 2 à 3 gouttes de chlorure ferrique en solution aqueuse 10%, puis 2 à 3 gouttes d’acide acétique glacial sont ajoutées. Après agitation, 0,3 ml de H2SO4 36 N est versé dans le tube incliné de 45°. La formation d’un anneau pourpre indique la présence de désoxyoses.

g) Iridoïdes

Un millilitre de HCl 6 N est ajouté à 1ml d’extrait aqueux. Le mélange est chauffé au bain-marie bouillant à 100°C pendant 30 min. Le virage de la coloration au bleu indique la présence d’iridoïdes dans l’extrait.

h) Quinones : test de BORNTRAGER

L’extrait aqueux de volume 1 ml est mélangé à 0,5 ml de benzène. Le mélange est agité énergiquement puis laissé décanter jusqu’à ce que deux phases soient nettement séparées. Ensuite, 0,5 ml d’ammoniaque (NH4OH) 25% est ajouté. La présence des quinones est montrée par la coloration de la phase inférieure en rouge.

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Première partie : Etude chimique
I-INTRODUCTION
II-MATERIELS ET METHODES
II.1 MATERIELS
II.1.1 Matériel végétal
II.1.1.1 Classification de la plante
II.1.1.2 Description botanique
II.1.1.3 Répartition géographique de l’espèce
II.1.1.4 Date et lieu de récolte
II.1.1.5 Préparation et mode de conservation du matériel végétal
II.1.2 Les produits chimiques
II.2 METHODES
II.2.1 Méthodes d’extraction
II.2.1.1 Extraction aqueuse à froid
II.2.1.2 Extraction par épuisements successifs
II.2.2 Méthodes de purification
II.2.2.1 Fractionnement avec l’acétate d’éthyle
II.2.2.2 Fractionnement avec le n-butanol
II.2.2.3 Dialyse
II.2.2.3.1 Principe
II.2.2.3.2 Mode opératoire
a) Préparation de la membrane
b) Déroulement de la dialyse
II.2.2.4 Chromatographie sur gel Sephadex G25
II.2.2.4.1 Principe
II.2.2.4.2 Mode opératoire
II.2.3 Méthode de concentration
II.2.4 Calcul de rendement
II.2.5 Méthodes d’analyse
II.2.5.1 Chromatographie sur couche mince
II.2.5.1.1 Principe
II.2.5.1.2 Mode opératoire
a) Dépôt des extraits
b) Développement de la plaque
c) Révélation du chromatogramme
II.2.5.2 Criblage phytochimique
II.2.5.2.1 Préparation des extraits
a) Extrait hydroéthanolique
b) Extrait acide
c) Extrait chloroformique
d) Extrait aqueux
II.2.5.2.2 Tests de détection des familles chimiques
a) Alcaloïdes
b) Flavonoïdes et leucoanthocyanes
c) Stéroïdes, triterpènes et stérols insaturés
d) Saponosides
e) Tanins et polyphénols
f) Désoxyoses
g) Iridoïdes
h) Quinones
III-RESULTATS
III.1 EXTRACTION
III.1.1 Extraction aqueuse à froid
III.1.2 Extraction par épuisements successifs
III.2 PURIFICATION
III.2.1 Fractionnement avec l’acétate d’éthyle
III.2.2 Fractionnement avec le n-butanol
III.2.3 Dialyse
III.2.4 Chromatographie sur gel Sephadex
III.3 RENDEMENT
III.4 DEGRE D’HOMOGENEITE
III.5 CARACTERISATION CHIMIQUE
III.5.1 Propriétés physico-chimiques
III.5.2 Criblage phytochimique
IV-DISCUSSION
Deuxième partie : Etude toxicologique
I-INTRODUCTION
II-MATERIELS ET METHODES
II.1 MATERIELS
II.1.1 Les animaux d’expérimentation
II.1.1.1 Les animaux à sang chaud : les souris
II.1.1.2 Les animaux à sang froid
a) Les alevins de poisson
b) Les têtards de grenouille
c) Les larves de moustique
II.1.2 Les végétaux d’expérimentation
II.1.3 Les matériels utilisés pour la microbiologie
II.1.3.1 Les microorganismes
II.1.3.2 Les milieux de culture
II.1.3.3 Les disques pour les tests d’antibiogramme
II.2 METHODES
II.2.1 Méthode d’étude des effets sur les animaux
II.2.1.1 Estimation de la toxicité sur souris
II.2.1.2 Détermination de la DL50 (24h) sur souris
1) Méthode de REED et MUENCH
2) Méthode de BOYD
II.2.1.3 Méthodes d’étude des effets sur les animaux à sang froid
II.2.1.3.1 Principe
II.2.1.3.2 Mode opératoire
a) Test sur les alevins de poisson
b) Test sur les têtards de grenouille
c) Test sur les larves de moustique
II.2.2 Méthodes d’étude des effets sur les végétaux
II.2.2.1 Etude des effets sur le pouvoir germinatif des graines
II.2.2.2 Etude des effets sur les bourgeons axillaires
II.2.3 Méthode d’étude des effets sur les microorganismes
II.2.3.1 Stérilisation
II.2.3.2 Préculture
II.2.3.2.1 Principe
II.2.3.2.2 Test proprement dit
II.2.3.3 Détermination de la CMI
II.2.3.4 Détermination de la CMB
III-RESULTATS
III.1 EFFETS SUR LES ANIMAUX
III.1.1 Effets sur les souris
III.1.1.1 Description des symptômes d’intoxication
III.1.1.2 Détermination de la DL50 (24h)
III.1.2 Effets sur les animaux à sang froid
III.1.2.1 Effets sur les alevins de poisson
III.1.2.2 Effets sur les têtards de grenouille
III.1.2.3 Effets sur les larves de moustique
III.2 EFFETS SUR LES VEGETAUX
III.2.1 Effets sur le pouvoir germinatif
III.2.2 Effets sur le développement des bourgeons axillaires
III.3 EFFETS SUR LES MICROORGANISMES
III.3.1 Test d’antibiogramme
III.3.2 Détermination de la CMI
III.3.3 Détermination de la CMB
IV-DISCUSSION
CONCLUSION GENERALE