Méthode de mesure de l’acidité titrable

Cours méthode de mesure de l’acidité titrable, tutoriel & guide de travaux pratiques en pdf.

Les leucocytes

Indication et méthode de mesure

Un nombre significatif de leucocytes indique une lésion inflammatoire situé dans l’appareil urinaire ou génital et qui est en contact avec l’urine (Chew et Dibartola, 1986).
Les bandelettes réactives aux leucocytes détectent la leucocyte-estérase se trouvant dans les granules cytoplasmiques dans les granulocytes.
Les tests de détection de cette activité leucocyte-estérase sont insensibles chez le chien. Il a été prouvé que les bandelettes à la leucocyte – estérase étaient spécifiques (93,2%) mais pas sensible (46%) lorsqu’elles étaient utilisée pour rechercher une pyurie dans des échantillons urinaires de chien.
Les tests à la leucocyte-estérase sont positifs dans la plupart des échantillons urinaires félins qui ne contiennent pas de leucocytes. De ce faite les bandelettes à la leucocyte estérase ne permettent pas de diagnostic dans cette espèce. En revanche, les mécanismes associés aux résultats faux positifs de ce test chez le chat ne sont pas connu (Osborne et Stevens, 1999).

Interprétation

La détection de leucocytes est typiquement une indication d’une pathologie inflammatoire. Les leucocytes associés à un nombre de bactéries, de champignons, ou d’œufs de parasites suffisamment élevé pour être observé au microscope dans le sédiment urinaire indiquent qu’une lésion inflammatoire a été causée ou se complique d’une infection urinaire.
Avec une sensibilité faible et une spécificité forte, ils indiquent la présence ou pas d’une bactériurie. Chez le chat, cette valeur n’est pas fiable et la recherche de bactérie dans l’urine passe par un examen direct d’urine fraiche et par la réalisation d’un culot de centrifugation (Osborne et Stevens, 1999).
La présence de plus de 5 leucocytes par champs à fort grossissement est en général considéré comme anormale et est appelé pyurie. Cependant, le nombre total de leucocytes se trouvant dans l’urine est modifié par de nombreux facteurs y compris la méthode de conservation, le volume de l’échantillon et sa concentration, l’ampleur de la destruction des leucocytes après leur prélèvement, et la technique de détection.
Les leucocytes sont rapidement lysés dans une urine alcaline ou hypotonique. Ce phénomène peut produire un test à la leucocytestérase positif en l’absence d’une pyurie microscopique significative.
Le nombre des leucocytes urinaires peut être réduit si les patients ayant une pathologie inflammatoire de l’appareil urinaire reçoivent des corticoïdes, ou des anti-inflammatoires non stéroïdien (Osborne et Stevens, 1999).

Le glucose

Indication et méthode de mesure

Chez l’homme, il existe normalement une petite quantité de glucose dans les urines (2 à 10 mg/100ml). Cependant cette quantité est insuffisante pour être détectée par les tests habituels utilisés lors de l’analyse urinaire de routine.
La détection d’une glucosurie doit faire suspecter un état d’hyperglycémie (Diabète sucré) ou de normoglycémie (tubulopathie) qui peuvent être physiologique (hyperglycémie de stress chez le chat), pharmacologie ou pathologique (Osborne et Stevens, 1999).
Toute bandelette urinaire possède une plage de détection pour le glucose. Ces plages contiennent une glucose oxydase ou peroxydase qui réagit avec la présence de glucose et donne un changement de couleur lors de la réaction.
Bien qu’il y ait différents chromogènes selon les bandelettes urinaires utilisées (l’iodure de potassium pour le Mutistix ®, le tétraméthyl de benzidine pour le Chemstrip ®), l’intensité et la nuance des couleurs sont grossièrement proportionnelles à la quantité de glucose dans les urines. L’enzyme glucose oxydase réagit spécifiquement avec le glucose. Cependant, les tests possèdent des indicateurs colorimétriques qui peuvent inhiber la réaction du test.
De plus, les résultats des tests peuvent être influencés par la température. Les échantillons réfrigérés doivent être remis à température ambiante avant leur examen pour la recherche de glucose. Le temps de réaction enzymatique est de 10 secondes.
Par ailleurs, des produits de nettoyage oxydants peuvent entraîner des glycosuries faussement positives. Enfin, la sensibilité de ces tests à la glucose oxydase peut être influencée par la détérioration du réactif et aussi par d’autres facteurs (Osborne et Stevens, 1999).
Bien évidemment, comme tout test semi-quantitatif, l’interprétation reste « clinicien dépendant »

 Interprétation

Pour l’interprétation, il est important de prendre en compte le fait que de faux positifs peuvent avoir lieu si l’échantillon est contaminé par de petite quantité de peroxyde d’hydrogène. De la même manière, des réactifs périmés ou exposés à la lumière peuvent donner des résultats erronés. Des concentrations modérément élevés en corps cétoniques (40mg/dl) peut engendrer de faux négatifs dans un échantillon contenant de faible quantités de glucose (75 à 125 mg/dl). Il a également été décrit que de grande quantité de bilirubine inhibaient le Clinistix ® et que la réactivité des plages réactives au glucose du Multistix ® peut diminuer avec l’augmentation de la densité (Osborne et Stevens, 1999).
L’utilisation des bandelettes urinaires lors de l’analyse urinaire de routine permet de mettre en évidence une glycosurie. Cette dernière peut être physiologique, pharmacologique ou pathologique.

Les corps cétoniques

Indications et méthode de mesure

Les corps cétoniques sont l’acide acéto-acétique, l’acétone et l’acide bétahydroxybutyrique. Cependant d’autres corps cétoniques peuvent être retrouvés dans l’urine.
La recherche de corps cétoniques dans l’urine chez les patients atteints de diabète est particulièrement important car la cétonurie diabétique suggère le développement d’un diabète acido-cétosique.
La physiologie de la cétonurie peut être classée comme suit :
-une baisse de la capacité à utiliser les glucides disponibles (diabète sucré)
-une consommation inadaptée de glucides (anorexie, modification de régime, exercices exténuants, exposition à un environnement froid)
-une perte de glucides (trouble tubulaire rénaux, et troubles digestifs)
La recherche des corps cétoniques en fin de gestation peut favoriser la détection d’une toxémie de gestation et d’une nutrition inadaptée lors de diabète sucré de gestation.
La plupart des tests utilisés lors de l’examen urinaire de routine (bandelette urinaire), sont basés sur la réaction de l’acide acéto-acétique et de l’acétone avec le nitroprussiate dans un environnement basique qui produit un composé coloré violet intense.
Petstix TM, Multistix ®, Ketostix ®, Labstix ® et Chemstrip ® contiennent des plages réactives imprégnées de nitroprussiate de sodium, de glycine et d’un tampon phosphate basique. Le tampon fournit le ph optimal de la réaction. La réaction ne détecte pas l’acide bétahydroxybutyrique et est beaucoup plus sensible à l’acide acétique qu’à l’acétone.
Après immersion de la bandelette urinaire dans l’urine, il est important d’examiner la couleur de la plage réactive au bon moment. En effet, le temps de réaction varie selon les bandelettes utilisées. Des modifications de couleur allant du chamois (beige) au violet indiquent une cétonurie. L’intensité de la couleur est proportionnelle à la quantité de cétones présente (Osborne et Stevens, 1999). Comme pour tout examen de la bandelette urinaire, on peut suggérer que l’interprétation de la plage peut être « clinicien dépendant ». Afin de s’affranchir de ce biais, on peut utiliser des lecteurs automatiques de bandelette urinaire. Une récente étude à prouvée que l’interprétation donnée par 2 vétérinaires concordaient avec les résultats de l’automate. Cependant cette étude fut réalisée par 2 lecteurs expérimentés (Baueret al., 2008). Cette étude révèle les mêmes résultats pour le ph, le glucose, la bilirubine, les protéines et le sang.

Interprétation

Tout d’abord, étant donné que l’acétone se volatilise à température ambiante, il est important de tester immédiatement les échantillons ou de les réfrigérer.
La partie cétonique de la bandelette urinaire est sensible aux effets de l’humidité, de la chaleur ou de la lumière. Le bouchon du tube à bandelette doit donc être remis juste après s’être servie pour réduire au maximum les faux négatifs.
Les fabricants indiquent que la limite inférieure de sensibilité de ces tests est de 5 à 10 mg/dl pour l’acide béta-hydroxybutyrique et 70 mg/dl pour l’acétone.
La cétonurie est rare chez les chiens (1,9%), et chez le chat (2,6%).
Normalement ils sont absents dans l’urine. Mais, on peut les y retrouver dans de nombreuses situations.
Le diabète sucré non contrôlé est la forme la plus souvent rencontrée de cétonurie chez les chiens et les chats. L’excrétion urinaire des cétones induit la perte systémique des électrolytes, ainsi qu’une hypokaliémie et hyponatrémie. La perte du sodium, potassium et cétone dans l’urine contribue à une augmentation de l’osmolarité urinaire du faite du glucose et de ce fait augmente l’importance de la polyurie associée au diabète.
Le jeun et les repas à faible teneur glucidique et riche en graisse peuvent aussi induire une cétonurie. Après le jeun, les animaux immatures risquent plus que les adultes de développer une cétonurie.
Enfin, un exercice peut même être suivi d’une cétonurie positive (Chew et Dibartola, 1986).

Erythrocytes, hémoglobine, myoglobine

Indication et méthode de mesure

Les tests de détection du sang dans les urines ont pour but de rechercher des concentrations d’hématie, d’hémoglobine, ou de myoglobine qui ne sont pas visible à l’œil nu.
Ces tests peuvent aider à identifier la cause d’une coloration anormale de l’urine. La présence ou l’absence d’hématie, d’hémoglobine ou de myoglobine peut avoir un intérêt pour localiser l’origine d’une protéinurie.
Comme l’examen microscopique du sédiment ne permet pas de détecter l’hémoglobine libre s’échappant des hématies lysées, le fait de se fier totalement à l’examen du sédiment pour la semi-quantification de l’hématurie pourra entraîner une sous-estimation grossière de l’importance de l’hématurie.
Ces tests peuvent faciliter la différenciation entre une micro-hématurie, et une hémoglobinurie ou une myoglobinurie par des moyens chimiques. Ils peuvent également aider à évaluer l’importance des lésions musculaires associées à la libération de la myoglobine (Osborne et Stevens, 1999).
Les tests habituels dépendent de la détection de l’activité pseudoperoxydase de la partie hème de l’hémoglobine et de la myoglobine dans l’urine.
Les composés de type porphyrine contenant du fer, appelés hème, agissent comme une peroxydase dans un environnement tamponné avec divers peroxydes comme substrats pour catalyser l’oxydation des substances du test. La substance du test développe diverses nuances de couleur d’intensité variable selon le réactif, la concentration de l’hème ou d’autres peroxydases et d’autres substances colorantes, et selon la présence ou l’absence d’inhibiteurs. La myoglobine et l’hémoglobine vont entraîner une réaction positive. Pour les tests de dépistage, les examens devront être réalisés sur des échantillons bien mélangés et non centrifugés.
Les bandelettes urinaires (Petstix TM, Hémastix ®, Multistix ®) peuvent donner des résultats positifs avec l’hémoglobine libre, la myoglobine ou encore la lyse de nombreuses hématies.

Interprétation

Faux positifs et Faux négatifs

♦ Faux positifs
Les enzymes comme les peroxydases bactériennes, leucocytaires, épithéliales et des spermatozoïdes peuvent potentiellement être la cause de résultats faux positifs, mais cela est peu vraisemblable.
La contamination de l’urine par une grande quantité d’iode ou de bromure est également une cause potentielle mais rare de faux positifs.
De la même manière, la contamination de l’urine par des agents oxydants contenus dans les désinfectants peut engendrer des faux positifs.
De plus, des concentrations en bilirubine supérieur à 8 mg/dl chez le chien provoquent une hématurie faussement positive (Osborne et Stevens, 1999).
♦ Faux négatifs
Etant donné que la sédimentation des hématies dans l’urine est rapide, cela peut expliquer la disparité entre l’examen du sédiment urinaire et les résultats de la bandelette urinaire.
Les bandelettes Multistix ® peut permettre la différenciation entre l’hémoglobine et les hématies intactes. Chemstrip ® permet de faire la différence entre un nombre faible, modéré et élevé de globules rouges et d’hémoglobinurie.

Rappel physiologique des hématies, de l’hémoglobine et de la myoglobine

♦ Hématies
Quelques hématies sont souvent présentent dans l’urine des chiens et des chats en bonne santé. Chez l’homme on accepte au maximum 5 hématies par microlitre ; c’est la microhématurie physiologique (Osborne et Stevens, 1999).
Cependant aucune détermination similaire n’a été établie chez les carnivores domestiques. Une hématurie est un indicateur non spécifique des maladies du tractus urinaire (Chew et Dibartola, 1986).