Etude moléculaire des CNV dans le trouble bipolaire à début précoce

Matériel et méthodes

Constitution de la collection d’ADN

Inclusion des patients bipolaires

Cette étude a été réalisée sur trois cohortes humaines dont une cohorte de 236 patients français (patients ayant au moins trois grands-parents français), comprenant 163 patients bipolaires
à début précoce (âge de début ≤ 21ans) et 69 cas familiaux (patients d’âge de début > 21 ans ayant au moins un apparenté au premier degré souffrant de trouble bipolaire). La constitution de cette cohorte est le résultat d’une dizaine d’années de collaboration entre plusieurs centres cliniques.
Les patients ont été inclus à Paris et Bordeaux, par des psychiatres expérimentés, et remplissaient les critères définis par le DSM-IV (American Psychiatric Association, Diagnostic and Statistical Manual , fourth edition) pour le trouble bipolaire 1 ou 2. Leur diagnostic a été évalué à l’aide de la Diagnostic Interview for Genetics Studies version 3.0 (Nurnberger et al., 1994). Tous étaient normothymiques au moment de l’inclusion. C’est-à-dire que les patients avaient un score inférieur à 5 pour le Montgomery-Asberg Depression Rating Scale, questionnaire utilisé pour mesurer la sévérité d’un épisode dépressif. Dix questions étaient posées aux sujets. Chaque réponse était notée sur 6, (0 représentant un état normal et 6 un état de dépression très sévère), (Montgomery et Asberg, 1979). Etaient considérés comme normothymiques les patients qui avaient également un score inférieur à 5 pour le Mania rating Scale, questionnaire utilisé pour évaluer la sévérité d’un épisode maniaque. Onze questions ont été posées aux patients. Chaque réponse était notée sur 4, (0 représentant un état normal et 4 un état maniaque sévère), (Bech et al., 1979). L’âge d’apparition des premiers symptômes de la maladie a été évalué de manière rétrospective.
La seconde cohorte était constituée de 235 patients allemands, comprenant 172 patients bipolaires à début précoce et 63 cas familiaux (patients d’âge de début > 21 ans ayant au moins un apparenté au premier degré souffrant de trouble bipolaire). Les critères d’inclusion des patients allemands dans l’étude étaient les mêmes que pour les patients français.
Un groupe contrôle était composé de 48 individus exempts de toute maladie psychiatrique et n’ayant pas d’apparenté du premier degré atteint de maladie psychiatrique.

Extraction d’ADN

L’ADN des patients a été extrait à partir de sang total prélevé sur EDTA (Ethyl Diamine Tétracide Acétique). Des lignées de lymphocytes B immortalisées par le virus d’Epstein Barr ont été générées pour chaque patient, afin de disposer d’une grande quantité d’ADN et ceci sur plusieurs années.
Les ADN ont été isolés à l’aide du kit Nucleon BACC 3 (GE Healthcare) et ont été stockés dans l’ADNthèque de l’Hôpital H. Mondor (Créteil). L’ADN d’autres membres de la famille (parents, frères et sœurs, enfants) était disponible dans certains cas et a également été archivé.

Dosage et estimation de la qualité de l’ADN

L’ADN a été dosé à l’aide du kit Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, (Invitrogen Carlsbad, CA, USA) selon les instructions du fabriquant.
La qualité de l’ADN a été évaluée par migration de 250ng d’ADN sur gel d’agarose à 0,8% pendant 2h à 50V.

Analyse des CNV

Détection des CNV

Nous avons réalisé une analyse bioinformatique des puces à ADN HumanHap 550 Beadchips (Illumina Inc. San Diego, Etats-Unis) pour les patients allemands et français. Les individus contrôles ont été génotypés à l’aide de puces HumanHap 1 million Beadchips (Illumina Inc. San Diego, Etats-Unis).
Une collaboration avec le Centre National de Génotypage (CNG : www.cng.fr) nous a permis de génotyper 236 patients français et 235 patients allemands pour plus de 550 000 SNP, et 48 contrôles pour plus d’un million de SNP, répartis tout au long du génome et de l’ADN mitochondrial. Quatre patients français, 15 patients allemands et 2 individus contrôles ont dû être exclus de l’étude à cause d’un génotypage de mauvaise qualité.
Les données générées par ces puces (550 000 et un million de SNP) ont été analysées à l’aide du logiciel SnipPeep (Version 1.0, auteur Roberto Toro) (Figure 7) qui représente l’intensité de fluorescence et le taux d’hétérozygotie de chaque SNP.
Figure 7. Représentation des caractéristiques de chaque SNP par le logiciel SnipPeep, pour chaque individu.
En abscisse est représentée la position sur le chromosome et en ordonnées l’intensité de fluorescence (rouge) et le taux d’hétérozygotie (vert) pour chaque SNP génotypé. La ligne bleue représente la médiane d’intensité de fluorescence et du taux d’hétérozygotie des SNP, cette ligne prédit le nombre de copie(s). A. Représentation d’une délétion. B. Représentation d’une duplication.
L’estimation de la présence de délétion ou duplication est fondée sur l’intensité de fluorescence et le taux d’hétérozygotie des SNP. La diminution ou l’augmentation de l’intensité de fluorescence de plusieurs SNP contigus nous permet de détecter les variants. La première vérification de la validation d’une délétion ou duplication est la diminution du taux d’hétérozygotie.
Nous avons ainsi pu repérer les délétions et duplications de chaque patient. Nous avons évalué la taille des variants en soustrayant la position chromosomique du dernier SNP inclus dans le variant, à la position chromosomique du premier SNP inclus dans le variant. Une recherche sur le site du Database of Genomic Variants (DGV http://projects.tcag.ca), base de données publique où sont répertoriés les variants connus et caractérisés dans la population générale humaine, a été effectuée, afin de vérifier si le variant était déjà répertorié dans la population générale.
Nous avons recherché sur le site de l’Université de Santa Cruz (UCSC Genome Browser ; http://genome.ucsc.edu), qui contient les données de séquence et l’annotation du génome humain, dans quelles régions se situaient les CNV : région contenant des gènes, des éléments régulateurs, des ESTs, et s’il y avait des gènes, quelle partie était touchée (exon ou intron). Le site UCSC Genome Browser nous a ainsi permis de voir quels gènes pourraient potentiellement être affectés et d’avoir facilement accès aux données concernant leur fonction et leur expression. Nous avons ensuite parcouru des sites tels que Online Mendelian Inheritance in Man, base de données des maladies génétiques humaines (OMIM, www.ncbi.nlm.nih.gov/omim), Ensembl, données de séquence et annotations de différents génomes (www.ensembl.org), GeneCards
(www.genecards.org), Allen Brain Atlas (www.brain-map.org), Pubmed (www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) afin d’affiner les données. Des informations complémentaires ont été ajoutées pour certains CNV, comme ceux présents dans une région du génome déjà associée au trouble bipolaire, ou à d’autres troubles psychiatriques.

Sélection des CNV

Nous avons sélectionné les CNV candidats pour le trouble bipolaire selon les critères suivants :
-le CNV interrompait un ou plusieurs exons codants d’un gène exprimé dans le cerveau ;
-le CNV était susceptible de modifier l’expression génique ou le fonctionnement d’une protéine;
-le CNV était présent chez plusieurs patients de la cohorte mais n’était pas répertorié dans la population générale.
-l’ADN du proposant, et éventuellement d’autres membres de la famille, était disponible et de bonne qualité.

Validation des CNV

Nous avons cherché à valider la présence des délétions et duplications par plusieurs méthodes quantitatives.
GeneScan
L’objectif de cette méthode était de quantifier la différence du nombre de copies d’ADN pour les régions suspectées contenir un CNV. Chaque région d’intérêt a été comparée à deux régions de référence pour lesquelles nous avons vérifié qu’aucun patient ni témoin ne présentait de CNV. Nous avons, ainsi, utilisé trois couples d’amorces pour chaque patient et chaque témoin.
Dans cette méthode nous avons utilisé pour chaque réaction 0,5 µM d’amorce sens marquée avec un fluorochrome FAM et 0,5 µM d’amorce antisens non marquée afin d’amplifier 100ng d’ADN, d’un patient ou d’un témoin, dans un mélange réactionnel de 20 µl comprenant 0,2 mM de dNTP, du tampon 1X, 0,75mM de MgCl2 et 0,25U de Taq DNA polymérase (Eurobio). Après une pré-dénaturation de 2 minutes à 94°C, 15, 20 ou 25 cycles d’amplification ont été réalisés selon les conditions suivantes : 30 secondes de dénaturation à 95°C, hybridation des amorces à 60°C pendant 30 secondes et 1 minute d’élongation à 72°C.
Après purification des produits obtenus en G50 sur Séphadex (Sigma Aldrich, Etats-Unis) selon les instructions du fabricant, les échantillons ont été déposés sur un séquenceur automatique ABIPRISM 3130 xl Genetic Analyser (Applied Biosystems).