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Cours biologie cellulaire PCEM1
Le transport nucléocytoplasmique de protéines est régulé par la petite GTPase nucléaire Ran, similaire à Ras. Ran est localisée majoritairement dans le noyau, mais en raison d’un cycle nucléocytoplasmique, de faibles quantités sont également présentes dans le cytoplasme. Le cycle de la GTPase Ran est modulé par l’interaction avec différentes protéines. RCC1 (ou RanGEF), le facteur d’échange de la guanine, est restreint au noyau, tandis que la protéine activatrice de Ran, RanGAP (qui hydrolyse le GTP en GDP), est concentrée dans le cytoplasme.
En raison de cette compartimentalisation des facteurs régulants Ran, la forme de Ran liée au GTP est principalement localisée dans le noyau, et le gradient qui en résulte contribue aux échanges de nombreuses protéines et de certains ARNs, à travers les pores nucléaires, par les importines et les exportines.
Le contrôle du transport nucléo-cytoplasmique contribue au contrôle spatial et temporel de la transcription, de la traduction, du cycle cellulaire, et des autres paramètres importants pour les décisions cellulaires.
Q1
– un oncogène est un gène dont il existe une version modifiée conduisant à la prolifération non contrôlée des cellules cancéreuses
– un proto-oncogène est la séquence non mutée d’un oncogène, codant généralement un facteur régulant positivement la prolifération (comme Ras)
– v-ONC est une version mutée d’un oncogène codée par un virus (animal)
– c-ONC est la version sauvage d’un oncogène, ou proto-oncogène
– un gène suppresseur de tumeur (PTEN, p53) : gène freinant la prolifération cellulaire, et dont les mutations inactivatrices conduisent à la transformation cancéreuses des cellules
1) Recherche de nouveaux partenaires de RSK
exp1A-C : crible double-hybride chez la levure (yeast two hybrid (Y2H) screen) les cellules de levure contenant les plasmides codant pour 3 formes de RSK, fusionnées au domaine d’activation de Gal4 (appât), sont transformés avec une banque de cDNA extraits d’embryons de souris de 9,5 jours fusionnés au domaine de liaison à l’ADN de Gal4 (proie) le crible identifie 3 clones contenant des fragments de cDNA codant pour la protéine RanBP3. Cette protéine est connue pour interagir directement avec Ran, et influencer le transport des protéines liées à RanGTP.
pGBDU-C3 : plasmide contenant le domaine de liaison à l’ADN du facteur de transcription Gal4 croissance sur milieu sans Adenine, Uracile ni Leucine
Le clone SKAR est connu pour interagir avec la protéine p70S6K1.
Q2
– le crible Y2H ne permet de retrouver que des partenaires directs
– le crible Y2H met en évidence des interactions qui ont nécessairement une pertinence physiologique
– le crible Y2H est applicable à tous les types de protéines
– une interaction se traduit par la reconstitution d’un facteur Gal4 fonctionnel
– une interaction se traduit par l’expression d’un gène rapporteur (ici d’un gène permettant la croissance des cellules sur milieu sélectif)
Q3
– Le clone SKAR co-transformé avec la protéine de fusion comprenant p70S6K1 constitue le contrôle positif
– le clone 8 co-transformé avec le vecteur pGBDU-C3 permet d’éliminer une activation non spécifique
– l’absence d’interaction avec la forme WT de RSK peut s’expliquer par une plus faible interaction de la forme complète avec RanBP3
– l’absence d’interaction avec la forme WT de RSK peut s’expliquer par un défaut de repliement de la protéine de fusion exprimée chez la levure
– un interaction en Y2H démontre l’interaction physique de 2 protéines
exp1D : co-immuno-précipitation (co-IP)
à l’aide de protéines de fusion, comportant des « tag », de brèves séquences (HA ou Flag) reconnues fortement par des anticorps spécifiques.
Des lignées cellulaires immortalisées, Human embryonic kidney (HEK) 293 cells ou human cervical carcinoma HeLa cells, sont transfectées avec HA-RSK ou un vecteur contrôle, et Flag-RanBP3 ;
48h après, les cellules sont traitées ou non avec du PMA pendant 15’, qui stimule la voie MAPK puis lysées avec 2 type de détergents (CHAPS ou TritonX100), avec ou sans DSP, un agent permettant le cross-link des protéines entre elles ;
le lysat est utilisé pour une immuno-précipitation (anti-HA) suivie d’un immuno-blot (anti-Flag)
PMA : phorbol 12-myristate 13-acetate
DSP : Dithio-bis[succinimidylpropionate]
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